姜燕強(qiáng)，陳俊麗，陳利平，段國華，張昆，劉亞利，劉英

武安市第一人民醫(yī)院，河北 武安 056300

腦出血是指非外傷所導(dǎo)致的腦實質(zhì)出血，約占腦卒中患者的30%，急性期死亡率超過35%，且超過50%的存活患者將伴有終身殘疾，極大地威脅著患者的生命健康和生活質(zhì)量[1]。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腦出血初期即出現(xiàn)的炎性細(xì)胞浸潤將加重腦組織水腫和繼發(fā)性腦損傷，在腦出血疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用。因此，抑制炎癥反應(yīng)作為腦出血的治療靶點成為當(dāng)前的研究熱點[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞為先天性免疫細(xì)胞，其在腦出血后最先被活化并分泌趨化因子、前列腺素等參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，其中Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)通路發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[3-5]。

中醫(yī)藥是具有獨特理論及技術(shù)方法的醫(yī)藥學(xué)體系，在腦出血治療領(lǐng)域逐漸得到關(guān)注與認(rèn)可。腦出血在中醫(yī)屬于“中風(fēng)”范疇，氣虛血瘀、痰瘀阻絡(luò)是其主要病機(jī)[6]。中藥穿心蓮是爵床科植物穿心蓮干燥地上部分，性寒、味苦，具有清熱解毒、涼血消腫之功效，常用于急性菌痢、肺炎、氣管炎、胃腸炎等疾病的治療。穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)是中藥穿心蓮的主要有效成分，具有良好的抗炎活性，能夠通過抑制TLR4/NF-κB通路改善膿毒癥所致心肺組織炎癥、細(xì)菌性肺部炎癥[7-9]。基于此，本研究探討穿心蓮內(nèi)酯對腦出血大鼠急性期炎癥反應(yīng)及TLR4/NF-κB通路的影響。

1 材料

1.1 實驗動物240只清潔級健康雄性SD大鼠，7周齡，體質(zhì)量220～240 g，購自河北省實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(冀)2018-004，動物合格號：202004012。分籠飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度25 ℃，相對濕度60%～70%，光照黑暗各12 h交替，自由進(jìn)食和飲水。本實驗經(jīng)武安市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(倫理批號：WASYY-KY-2020-013)。

1.2 藥物與試劑穿心蓮內(nèi)酯膠囊(惠州市九惠制藥股份有限公司，批號：20191217)；尼莫地平膠囊(海南普利制藥股份有限公司，批號：200125)。伊文思藍(lán)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：W20190418)；白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA檢測試劑盒、HE試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：200130、200413、200105、191014)；TLR4抗體、NF-κB抗體、β-肌動蛋白(β-actin)抗體、IgG二抗、2，2′-聯(lián)喹啉-4，4′-二甲酸二鈉(2，2′-biquinoline-4，4′-dicarboxylic acid disodium salt，BCA)、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-20595R、bs-20355R、bs-0061R、bs-0295G、D10616、C05-07004)。

1.3 儀器BN-51700型腦立體定位儀(美國Stoelting公司)；100 μL微量注射器(上海安亭微量進(jìn)樣儀器廠)；SpectraMax M3型多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；Allegra 21R型低溫離心機(jī)(美國Beckman公司)；EG1150型包埋機(jī)、CM1950型冰凍切片機(jī)(德國Leica公司)；SE300型蛋白質(zhì)電泳儀(美國Hoefer公司)；VE186型轉(zhuǎn)膜儀(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備與給藥采用隨機(jī)數(shù)字表法將240只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組和穿心蓮內(nèi)酯低、中、高劑量組，每組40只。除假手術(shù)組外，其余組大鼠均參照文獻(xiàn)報道的自體血注射法制備腦出血大鼠模型[10]，具體如下：大鼠禁食禁水12 h后，以3 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉，經(jīng)左側(cè)股動脈取血后俯臥位固定于腦立體定位儀下，沿正中切開頭皮和骨膜、暴露前囟，在中線右旁3.5 mm與前囟前 0.2 mm 交匯處鉆孔，通過微量注射器在腦基底節(jié)區(qū)(深度6 mm)以10 μL·min-1速度注射50 μL自身股動脈血，無菌骨蠟封閉鉆孔，逐層縫合皮膚。大鼠清醒后，按照Zea-Longa評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分：神經(jīng)功能無缺損為0分；左側(cè)前肢不能完全伸展為1分；行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；行走時向左側(cè)傾倒為3分；意識喪失為4分。當(dāng)大鼠的Zea-Longa 評分≥2分時，即為造模成功[11]。造模完成后，尼莫地平組灌胃給予濃度2 g·L-1的尼莫地平溶液[12]，穿心蓮內(nèi)酯低、中、高劑量組分別灌胃給予濃度5 g·L-1、10 g·L-1、20g·L-1的穿心蓮內(nèi)酯溶液(根據(jù)人和大鼠藥物劑量換算公式，分別為0.5倍、1倍、2倍的人臨床劑量)，假手術(shù)組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，灌胃體積均為 5 mL·kg-1，每天1次，療程7 d。

2.2 采用改良神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準(zhǔn)(modified neurological scoring standard，mNSS)進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評分按隨機(jī)數(shù)字表法每組各取8只大鼠，對照mNSS評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評分[13]，得分越高則說明神經(jīng)功能缺失越嚴(yán)重。

2.3 采用多田公式計算腦血腫體積[12]大鼠神經(jīng)功能缺損評分后以3 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉，頸椎脫臼處死大鼠并迅速斷頭，剝?nèi)∧X組織并置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，采用高速冷凍切片機(jī)以注射給藥針孔為中心連續(xù)切片(厚度0.5 mm)，血腫為暗紅色，檢測血腫最大層面互為垂直的最大橫徑和最大縱徑長度，然后根據(jù)多田公式計算腦血腫體積。

血腫體積(mm3)=(π/6)×最大橫徑(mm) ×最大縱徑(mm)×血腫層數(shù)×切片厚度(mm)

2.4 干濕比重法計算腦含水量按隨機(jī)數(shù)字表法各組另取8只大鼠，以3 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉后，頸椎脫臼處死大鼠并迅速斷頭，剝?nèi)∧X組織后采用生理鹽水沖洗并拭干，取去除小腦和腦干后的大腦和間腦，稱其質(zhì)量為濕質(zhì)量(W濕)，置于烘箱中100 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱其質(zhì)量為干質(zhì)量(W干)，計算腦含水量。

腦含水量=(W濕-W干)/W濕×100%

2.5 伊文思藍(lán)滲透法測定血腦屏障(blood brain barrier，BBB)通透性按隨機(jī)數(shù)字表法各組另取8只大鼠，以4 mL·kg-1的體積尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)溶液，1 h后以3 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉，開胸暴露大鼠心臟，由左心室-右心耳通路由快到慢灌注300 mL生理鹽水后大鼠斷頭并剝?nèi)∧X組織，切取右側(cè)半腦，研磨勻漿后加入質(zhì)量體積比13的50%甲酰胺溶液，60 ℃ 孵育24 h后3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，取上清液，酶標(biāo)儀檢測610 nm波長處的光密度值(optical density，OD)，用標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算腦組織伊文思藍(lán)含量，通過腦組織伊文思藍(lán)含量反映BBB通透性。

2.6 HE染色檢查腦組織病理學(xué)按隨機(jī)數(shù)字表法各組另取8只大鼠，以3 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉后，頸椎脫臼處死并迅速斷頭、剝?nèi)∧X組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h后，通過高速冷凍切片機(jī)、以注射給藥針孔為中心連續(xù)切片(厚度4 μm)，按照HE染色試劑盒操作說明依步處理，通過光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠腦組織病理學(xué)改變。

2.7 ELISA法檢測腦組織和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平取各組剩余的8只大鼠，以 3 mL·kg-1的體積腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉后，經(jīng)腹主動脈取血并1 500 r·min-1離心 5 min(離心半徑8 cm)，取血清。頸椎脫臼處死大鼠，迅速斷頭、在冰上剝?nèi)∧X組織，取右腦注射給藥針孔周圍腦組織，剪碎后加入4 ℃ RIPA裂解液在冰上靜置30 min使其充分裂解，3 500 r·min-1離心10 min(離心半徑8 cm)，取上清液。參照ELISA試劑盒操作說明書，依步驟處理后通過酶標(biāo)儀檢測腦組織和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。

2.8 Western Blot檢測腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平取2.7制備的腦組織裂解溶液，4 ℃、12 000 r·min-1離心25 min(離心半徑8 cm)后取上清液，BCA法檢測總蛋白濃度，沸水浴10 min使蛋白變性后分別取30 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳(120 V電壓50 min，80 V電壓40 min)分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)PVDF膜后置于5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，滴加TLR4(稀釋比例為11 000)、NF-κB(稀釋比例為11 000)、β-actin(稀釋比例為 12 000)抗體后4 ℃孵育過夜，洗膜后滴加IgG二抗(稀釋比例為15 000)室溫孵育1.5 h，洗膜后滴加ECL顯色，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參(β-actin)條帶灰度值的比值計算目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯中、高劑量組和尼莫地平組大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與尼莫地平組比較，穿心蓮內(nèi)酯高劑量組神經(jīng)功能缺失評分、腦血腫體積顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見圖1，表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦血腫體積、腦含水量比較

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：穿心蓮內(nèi)酯低劑量組；D：穿心蓮內(nèi)酯中劑量組；E：穿心蓮內(nèi)酯高劑量組；F：尼莫地平組

3.2 各組大鼠腦組織病理學(xué)改變HE染色發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠未見腦組織血腫，腦組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)未見異常；模型組大鼠可見血腫紅細(xì)胞，腦組織呈現(xiàn)明顯水腫，神經(jīng)元數(shù)量減少、形態(tài)不規(guī)則、間隙增大，胞核固縮深染、大量炎性細(xì)胞浸潤等病理學(xué)改變；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯低、中、高劑量組和尼莫地平組大鼠腦組織病理學(xué)改變呈現(xiàn)不同程度的改善，且穿心蓮內(nèi)酯高劑量組效果最佳。見圖2。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：穿心蓮內(nèi)酯低劑量組；D：穿心蓮內(nèi)酯中劑量組；E：穿心蓮內(nèi)酯高劑量組；F：尼莫地平組

3.3 各組大鼠BBB通透性比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯中、高劑量組和尼莫地平組腦組織伊文思藍(lán)含量顯著降低(P<0.01)；與尼莫地平組比較，穿心蓮內(nèi)酯高劑量組腦組織伊文思藍(lán)含量顯著降低(P<0.01)。見圖3、表2。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：穿心蓮內(nèi)酯低劑量組；D：穿心蓮內(nèi)酯中劑量組；E：穿心蓮內(nèi)酯高劑量組；F：尼莫地平組

表2 各組大鼠腦組織伊文思藍(lán)含量比較

3.4 各組大鼠腦組織和血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織和血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯中、高劑量組和尼莫地平組腦組織和血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與尼莫地平組比較，穿心蓮內(nèi)酯高劑量組腦組織IL-6、TNF-α 含量顯著降低(P<0.05)，血清IL-6、TNF-α 及IL-1β含量極顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠腦組織及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

3.5 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，穿心蓮內(nèi)酯中、高劑量組和尼莫地平組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)；與尼莫地平組比較，穿心蓮內(nèi)酯高劑量組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖4、表4。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：穿心蓮內(nèi)酯低劑量組；D：穿心蓮內(nèi)酯中劑量組；E：穿心蓮內(nèi)酯高劑量組；F：尼莫地平組

表4 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白相對表達(dá)量比較

4 討論

腦出血是一種發(fā)病急且致殘、致死率高的腦血管疾病，目前臨床上主要采取外科手術(shù)結(jié)合血壓管理的治療方案，雖能挽救部分患者生命，但急性期死亡率和存活患者殘疾率仍居高不下。腦出血病理機(jī)制復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)在腦出血急性期及繼發(fā)性腦損傷過程中發(fā)揮著重要作用[14]。

隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的深入，中藥活性提取物在臨床中的應(yīng)用逐漸廣泛。穿心蓮內(nèi)酯為我國傳統(tǒng)中藥穿心蓮的主要有效成分，屬于二萜內(nèi)酯類化合物，具有良好的抗炎活性，目前臨床上主要用于上呼吸道感染、細(xì)菌性痢疾的治療。尼莫地平為鈣離子拮抗劑類降壓藥，是臨床防治蛛網(wǎng)膜下腔出血等急性腦血管病的常用藥物。本實驗采用自體血注射法制備腦出血大鼠模型，模型大鼠呈現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺失、腦含水量升高，腦組織可見水腫、神經(jīng)元數(shù)量減少、胞核固縮深染、炎性浸潤等病理學(xué)改變，與田青等[15]報道一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯或尼莫地平治療7 d能夠明顯降低腦出血大鼠急性期神經(jīng)功能缺失評分、腦含水量和腦血腫體積，明顯改善腦出血所致腦組織病理學(xué)改變，改善BBB通透性，并且穿心蓮內(nèi)酯高劑量組效應(yīng)優(yōu)于尼莫地平組，提示穿心蓮內(nèi)酯具有抑制腦出血大鼠急性期腦組織損傷的作用。

炎癥反應(yīng)貫穿在出血性腦損傷的全過程，是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的重要原因。小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等均參與腦出血后炎癥反應(yīng)過程[16]。其中，小膠質(zhì)細(xì)胞是特異性存在于腦組織中的免疫細(xì)胞，具有抗原傳遞、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等生理學(xué)作用，腦出血發(fā)生后血腫占位和顱內(nèi)高壓等將病理性刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化，分泌細(xì)胞因子、炎性趨化因子而引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[17]。活化小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6是引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要原因，并且IL-1β、TNF-α作為炎性趨化因子能夠進(jìn)一步刺激粒細(xì)胞合成與釋放 IL-6 等炎性因子，從而形成炎癥級聯(lián)反應(yīng)[18]。此外，腦出血后，星型膠質(zhì)細(xì)胞能夠被病理性激活，進(jìn)而釋放IL-6、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)等炎性細(xì)胞因子[19]；中性粒細(xì)胞黏附于血腫周圍腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，快速浸潤進(jìn)入腦組織并釋放炎性趨化因子[20]；T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫系統(tǒng)的重要組成部分，有研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+等能夠通過BBB進(jìn)入腦組織而引發(fā)炎癥反應(yīng)[21]。緊密連接復(fù)合體是BBB的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，陸正齊[22]和Dohgu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6、TNF-α將破壞緊密連接復(fù)合體的結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，從而導(dǎo)致BBB通透性升高。本研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯或尼莫地平治療7 d能夠明顯降低腦出血大鼠急性期腦組織和血清 IL-1β、IL-6、TNF-α含量，并且穿心蓮內(nèi)酯高劑量組的效應(yīng)明顯優(yōu)于尼莫地平組，提示穿心蓮內(nèi)酯對腦出血后炎癥反應(yīng)具有抑制作用，并說明穿心蓮內(nèi)酯對腦出血后BBB損傷的保護(hù)作用可能與其抑制炎癥作用有關(guān)。

TLR是一類跨膜識別受體，其中TLR4廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞中，在腦組織免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的信號傳導(dǎo)作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，腦出血大鼠腦組織TLR4蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，該結(jié)果與張玉杰等[25]研究報道一致。NF-κB為TLR4下游靶基因，能夠被TLR4誘導(dǎo)表達(dá)與活化，活化NF-κB核轉(zhuǎn)位后能夠誘導(dǎo)IL-1、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子釋放，從而加重炎癥反應(yīng)[26]。因此，TLR4/NF-κB信號通路在腦組織炎癥反應(yīng)過程中具有重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯或尼莫地平治療7 d能夠明顯下調(diào)腦出血大鼠腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平，并且穿心蓮內(nèi)酯高劑量組對TLR4、NF-κB表達(dá)的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于尼莫地平組，提示穿心蓮內(nèi)酯對腦出血后炎癥反應(yīng)的抑制作用可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)。

綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制腦出血大鼠急性期炎癥反應(yīng)，減輕腦組織損傷，其機(jī)制可能與穿心蓮內(nèi)酯抑制TLR4/NF-κB信號通路激活有關(guān)，本研究結(jié)果為穿心蓮內(nèi)酯作為腦出血急性期治療備選藥物提供了支持。