賀穩(wěn)，陳晗，朱明明，楊學(xué)攀，余曦，施洪飛

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院，江蘇 泰州 215300

缺血性心臟病(ischemic heart disease，IHD)主要是由動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)病變引起，其發(fā)病率和死亡率逐年升高，成為人類健康的主要威脅[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞激活是AS的顯著特征，也是AS最重要的始動(dòng)因素[2]。美國(guó)Ross教授提出，AS是一種慢性炎癥性疾病[3]，內(nèi)皮功能障礙會(huì)促進(jìn)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等向血管壁黏附聚集，致使血管壁發(fā)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重血管內(nèi)皮損傷，從而促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[4]。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是AS進(jìn)程中的兩個(gè)關(guān)鍵成分[5-6]，當(dāng)受到炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等刺激時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞可表達(dá)一組復(fù)雜的基因，例如E-選擇素(E-selectin)、細(xì)胞間黏附因子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附因子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)以及其受體等[7]，并參與到炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB)是機(jī)體抗炎和抗氧化的關(guān)鍵調(diào)控因子，在保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究表明，抑制NF-κB的激活可減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，改善心肌功能[8]。因此，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能是一個(gè)有效的干預(yù)靶點(diǎn)，阻斷NF-κB激活可能是防治心血管疾病的關(guān)鍵策略。

中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為IHD屬于“胸痹”“真心痛”等疾病范疇，其基本病機(jī)主要為“本虛標(biāo)實(shí)”，即臟器虛衰，無(wú)力推動(dòng)血液運(yùn)行，造成“血瘀”實(shí)證。國(guó)醫(yī)大師張磊教授[9]認(rèn)為治療胸痹心痛無(wú)論虛實(shí)，以祛邪通絡(luò)為先，活血通經(jīng)藥物為基礎(chǔ)。杜武勛等[10]強(qiáng)調(diào)“血瘀”作為急性心肌梗死的基本病機(jī)，在治療中應(yīng)以活血化瘀為主，標(biāo)本兼治。紅花是活血通經(jīng)、化瘀止痛的代表藥物，羥基紅花黃色素A(hydroxy safflor yellow A)是其關(guān)鍵活性成分。大量研究表明，羥基紅花黃色素A具有改善心肌缺血、抑制血栓形成、抗氧化、抗炎和抗凋亡等多種藥理作用[11]。本課題組前期研究表明，羥基紅花黃色素A可以通過(guò)改善缺氧復(fù)氧損傷減輕內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[12]。為進(jìn)一步研究羥基紅花黃色素A對(duì)心肌缺血損傷過(guò)程中的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用人重組TNF-α構(gòu)建人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926損傷模型，探討羥基紅花黃色素A預(yù)處理對(duì)TNF-α誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及NF-κB信號(hào)通路在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激中的調(diào)節(jié)機(jī)制，為紅花對(duì)IHD的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)：GNHu39)。

1.2 藥品和試劑羥基紅花黃色素A(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)：H117996，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；TNF-α(美國(guó)Peprotech公司，批號(hào)：AF-300-01A)。胎牛血清(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：10099-141)；不完全高糖培養(yǎng)基、蛋白提取試劑盒、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物公司，批號(hào)：KGM12800-500、KGP2100、KGP150)；細(xì)胞毒性活性檢測(cè)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8，南京翼飛雪生物科技有限公司，批號(hào)：GK10001)；Hoechest染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：C1017)；一氧化氮(nitric oxide，NO)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A012-1-2)；內(nèi)皮素(endothelin-1，ET-1)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)：m1025100)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號(hào)：R223-01、Q321-02)；MCP-1抗體(北京Bioss公司，貨號(hào)：bs-23026R)；E-selectin、β-actin抗體(武漢Proteintech公司，貨號(hào)：20894-1-AP、81115-1-RR)；VCAM-1抗體(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab134047)；ICAM-1和p-IкB-α抗體(美國(guó)Affinity公司，貨號(hào)：AF6088、AF2002)；IкB-α、P65、P50抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，貨號(hào)：4412、4764、13586)。

1.3 儀器3131型CO2培養(yǎng)箱、MICROCL 21R型冷凍離心機(jī)、CXX31型倒置熒光顯微鏡(日本尼康公司)；Multiskan spectrum 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；1658000型電泳儀、1703940型半干轉(zhuǎn)膜儀、1708865型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、1708265型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Arium comfot1型純水超純水系統(tǒng)一體機(jī)(德國(guó)Sartorius公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)EA.hy926細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS、80 U·mL-1青霉素及0.08 g·L-1鏈霉素的不完全高糖DMEM培養(yǎng)基中，并置于 37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8法檢測(cè)EA.hy926細(xì)胞活力

2.2.1 檢測(cè)不同濃度TNF-α刺激EA.hy926細(xì)胞后的細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)，接種于96孔板，每孔6.0×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的TNF-α(0 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1)干預(yù)24 h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入含10%CCK-8溶液的培養(yǎng)液100 μL，置于 37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h后，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)測(cè)定每孔吸光度值(absorbance，A)，計(jì)算細(xì)胞存活率，以確定TNF-α的造模濃度。

細(xì)胞活力=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%

2.2.2 檢測(cè)不同濃度羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞損傷模型細(xì)胞活力的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)，接種于96 孔板，每孔5.0×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的羥基紅花黃色素A(0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、100 μmol·L-1) 預(yù)處理24 h后，加入TNF-α(劑量為“2.2.1項(xiàng)”篩選出的最佳造模濃度)干預(yù)24 h，對(duì)照組細(xì)胞以 0.1% DMSO處理。檢測(cè)方法同2.2.1項(xiàng)，計(jì)算細(xì)胞存活率，以確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)羥基紅花黃色素A的干預(yù)濃度。

2.3 Hoechest染色檢測(cè)EA.hy926細(xì)胞凋亡情況將蓋玻片置于75%乙醇中浸泡3 min，取出晾干后用高溫滅菌好的1×PBS洗滌2遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液清洗1遍。清洗好的蓋玻片置于培養(yǎng)皿內(nèi)并加入細(xì)胞混懸液，分為對(duì)照組、不同濃度TNF-α組及TNF-α(劑量為“2.2.1項(xiàng)”篩選出造模濃度)+不同濃度羥基紅花黃色素A組。對(duì)照組細(xì)胞以 0.1% DMSO處理。待培養(yǎng)結(jié)束后吸盡培養(yǎng)液，加入 0.5 mL 固定液，固定10 min后吸盡PBS，在培養(yǎng)皿內(nèi)加入0.5 mL Hoechest33258染色液，5 min后吸盡染色液，PBS洗滌2次，每次3 min。將一滴抗熒光淬滅封片液滴在載玻片上，再將有細(xì)胞的蓋玻片蓋在載玻片上，充分接觸封片液，避免產(chǎn)生氣泡，并用指甲油固定蓋玻片邊緣，迅速置于熒光顯微鏡下(×200)進(jìn)行觀察并拍片。

2.4 細(xì)胞上清液中NO、ET-1含量的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，顯微鏡下計(jì)數(shù)，接種于 24孔板中，每孔接種2.5×104個(gè)細(xì)胞，置于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為4組，分別為對(duì)照組、TNF-α組、1 μmol·L-1羥基紅花黃色素A組和10 μmol·L-1羥基紅花黃色素A組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，加入相應(yīng)濃度的羥基紅花黃色素A預(yù)處理24 h后加TNF-α(劑量為“2.2.1項(xiàng)”篩選出造模濃度)干預(yù)24 h，對(duì)照組細(xì)胞以 0.1% DMSO處理。收集上清液，硝酸還原酶法檢測(cè)NO 含量，ELISA 法檢測(cè) ET-1含量，所有操作均按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.5 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)E-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1以及NF-кB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞分為3組，對(duì)照組、TNF-α組和10 μmol·L-1羥基紅花黃色素A組。細(xì)胞貼壁后，加羥基紅花黃色素A預(yù)處理24 h后加TNF-α(劑量為“2.2.1項(xiàng)”篩選出造模濃度)干預(yù)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后將細(xì)胞取出，PBS清洗2次，按照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取 EA.hy926 細(xì)胞總蛋白，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒制備細(xì)胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞核蛋白。BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行三次評(píng)估，取三次的平均值。將計(jì)算好的蛋白樣本與5×上樣緩沖液混合，100 ℃煮5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。上樣?20 V、20 min電泳至上層膠分開(kāi)后200 V、35 min 電泳至結(jié)束。10 V、1 h轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂牛奶封閉 1 h。一抗(稀釋比例11 000)4 ℃搖床，最小轉(zhuǎn)速孵育過(guò)夜?；厥找豢梗?×TBST 洗膜3次，每次10 min。二抗(稀釋比例110 000)室溫低速搖床孵育1 h，棄去二抗，1×TBST洗膜3次，每次 10 min，之后繼續(xù)1×TBST洗膜4次，每次10 min。按照說(shuō)明書配制好發(fā)光液(11)，用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，盡量保持在避光的狀態(tài)下操作，將成像的條帶保存，并使用Image J對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

2.6 RT-qPCR檢測(cè)SOD、CAT、GSH-pxmRNA的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿中，分組同“2.5”項(xiàng)。培養(yǎng)結(jié)束后將細(xì)胞取出，吸盡培養(yǎng)液，加入1 mL Trizol提取RNA，蛋白核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。按Real-timePCR試劑盒說(shuō)明書配制反應(yīng)體系：10 μL 2×Cham QSYBR qPCR Master Mix、0.4 μL Primer1 (10 μmol·L-1)、0.4 μL Primer2(10 μmol·L-1)、1 μL cDNA，加入DEPC水至 20 μL，每組3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃、5 min預(yù)變性；95 ℃、10 s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s擴(kuò)增，40個(gè)循環(huán)；70 ℃、5 s，95 ℃、5 s溶解。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司提供，序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 TNF-α對(duì)EA.hy926細(xì)胞活力及凋亡的影響實(shí)時(shí)生長(zhǎng)圖片監(jiān)測(cè)顯示，與0 μg·L-1TNF-α組比較，20 μg·L-1TNF-α組、50 μg·L-1TNF-α組細(xì)胞密度明顯下降，見(jiàn)圖1A；CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0 μg·L-1TNF-α組比較，隨著TNF-α濃度增加，其對(duì)EA.hy926細(xì)胞活力的抑制作用顯著增強(qiáng)(P<0.01或P<0.001)，見(jiàn)圖1B。Hoechest染色結(jié)果顯示，20 μg·L-1TNF-α組、50 μg·L-1TNF-α組細(xì)胞核體積明顯縮小、破碎，且呈深染核形態(tài)，說(shuō)明TNF-α能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖1C。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇20 μg·L-1TNF-α為造模條件。

注：A：細(xì)胞生長(zhǎng)情況比較；B：細(xì)胞活力比較；C：細(xì)胞凋亡情況比較；與0 μg·L-1 TNF-α比較，**P<0.01，***P<0.001；圖中標(biāo)尺長(zhǎng)度代表100 μm；n=6

3.2 羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞損傷模型細(xì)胞活力及凋亡的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，TNF-α能夠明顯抑制EA.hy926細(xì)胞活力(P<0.001)；與 TNF-α組比較；羥基紅花黃色素A (1～10 μmol·L-1)預(yù)處理可明顯改善TNF-α刺激后EA.hy926細(xì)胞活力，其中以10 μmol·L-1作用尤為顯著(P<0.001)，但羥基紅花黃色素A的濃度為100 μmol·L-1時(shí)對(duì)細(xì)胞的活力反而具有抑制作用。Hoechest染色結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，TNF-α組細(xì)胞核體積明顯縮小、破碎，呈深染核形態(tài)；與 TNF-α 組比較，羥基紅花黃色素A(1～10 μmol·L-1)預(yù)處理組顯示細(xì)胞核深染形態(tài)減少，10 μmol·L-1羥基紅花黃色素A組效果更為明顯。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1 μmol·L-1、10 μmol·L-1羥基紅花黃色素A作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞預(yù)處理濃度。見(jiàn)圖2。

3.3 羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞損傷模型細(xì)胞上清液中NO及ET-1含量的影響與對(duì)照組比較，TNF-α組細(xì)胞釋放的NO含量顯著減少(P<0.001)，而ET-1含量顯著增多(P<0.001)；與TNF-α組比較，10 μmol·L-1羥基紅花黃色素A預(yù)處理能顯著增加細(xì)胞NO的釋放并降低ET-1的水平(P<0.01)，見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A可以通過(guò)調(diào)節(jié)NO/ET-1 平衡來(lái)改善TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。在此基礎(chǔ)上選擇10 μmol·L-1羥基紅花黃色素A作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞預(yù)處理的最佳濃度。

表2 各組NO、ET-1水平比較

3.4 羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞中E-selectin、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)水平的影響血管內(nèi)皮產(chǎn)生損傷時(shí)，局部會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)，炎癥區(qū)域可產(chǎn)生和釋放相關(guān)炎癥因子，本研究用TNF-α刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h，Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TNF-α組細(xì)胞中E-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01或P<0.001)；與TNF-α組比較，羥基紅花黃色素A組E-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖3。

注：A：E-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白條帶圖；B：E-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1蛋白量化結(jié)果比較；n=3；與對(duì)照組比較，**P<0.01，***P<0.001；與TNF-α組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.5 羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TNF-α組細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-pxmRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01或P<0.001)；與TNF-α組比較，羥基紅花黃色素A組SOD、CAT、GSH-pxmRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)。由此證明，炎癥介質(zhì) TNF-α 可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生過(guò)氧化損傷，而羥基紅花黃色素A預(yù)處理對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞氧化應(yīng)激具有抑制作用。見(jiàn)圖4。

注：A：SOD mRNA結(jié)果比較；B：CAT mRNA結(jié)果比較；C：GSH-px mRNA結(jié)果比較；n=3；與對(duì)照組比較，**P<0.01，***P<0.001；與TNF-α組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.6 羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響為進(jìn)一步確定羥基紅花黃色素A對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的 EA.hy926細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)作用的潛在機(jī)制，本研究分析了NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，TNF-α組p-IκB-α及細(xì)胞核中P65、P50蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01或P<0.001)，IκB-α 及細(xì)胞漿中P65、P50蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01或P<0.001)，提示TNF-α可促進(jìn) IκB-α 的磷酸化及P65/P50轉(zhuǎn)位入核；與TNF-α組比較，羥基紅花黃色素A組p-IκB-α及細(xì)胞核中P65、P50蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，IκB-α 及細(xì)胞漿中P65、P50蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明羥基紅花黃色素A可抑制 TNF-α 誘導(dǎo)的IκB-α的磷酸化及P65/P50轉(zhuǎn)位入核。這些結(jié)果提示羥基紅花黃色素A可抑制TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB活性，從而發(fā)揮抗炎和抗氧化作用。見(jiàn)圖5。

注：A：IκB-α及p-IκB-α蛋白表達(dá)條帶圖及量化結(jié)果比較；B：細(xì)胞漿中P65、P50蛋白表達(dá)條帶圖及量化結(jié)果比較；C：細(xì)胞核中P65、P50蛋白表達(dá)條帶圖及量化結(jié)果比較；n=3；與對(duì)照組比較，**P<0.01，***P<0.001；與 TNF-α組比較，#P<0.05，##P<0.01

4 討論

近幾十年來(lái)，伴隨人口老齡化的增長(zhǎng)和人們生活方式的多樣化，缺血性心臟病已然上升為威脅國(guó)民生命健康的主要原因[13]。AS是多種心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，也是缺血性心臟病最常見(jiàn)病因，因此，加強(qiáng)防治AS刻不容緩。研究發(fā)現(xiàn)，AS進(jìn)程中氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)損傷機(jī)制與中醫(yī)學(xué)血瘀證理論密切相關(guān)[14-15]。炎性因子和氧化因子在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，最終導(dǎo)致缺血性心肌損傷[2，6，16]。在此認(rèn)識(shí)的指導(dǎo)下，深入研究活血化瘀中藥在AS進(jìn)程中抵抗內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的作用及其可能機(jī)制有助于為臨床上應(yīng)用活血化瘀中藥防治缺血性心臟病提供科學(xué)依據(jù)。

研究證明，NO和ET-1是一對(duì)作用相反的血管活性分子，是反映血管內(nèi)皮功能的代表性指標(biāo)[17]。調(diào)節(jié)NO /ET-1動(dòng)態(tài)平衡有利于維持血管內(nèi)皮功能正常，從起始環(huán)節(jié)干預(yù)AS的形成，有效防治AS導(dǎo)致的心腦血管疾病[18-19]。本研究結(jié)果顯示，羥基紅花黃色素A預(yù)處理可以促進(jìn)NO的釋放，抑制ET-1水平的升高，從而改善TNF-α誘導(dǎo)的EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。

血管炎癥是AS的關(guān)鍵病理生理反應(yīng)[20]，及時(shí)的抗炎措施有利于減緩AS的進(jìn)程。E-selectin主要表達(dá)于活化的內(nèi)皮細(xì)胞中，在AS的早期階段極大影響了白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用[21]。MCP-1 能夠介導(dǎo)白細(xì)胞聚集到損傷部位，與損傷的組織細(xì)胞黏附，引起組織二次損傷[22]。ICAM-1和 VCAM-1 參與白細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)運(yùn)，在響應(yīng)炎癥細(xì)胞因子刺激時(shí)被上調(diào)[23-24]。氧化應(yīng)激同樣在AS中發(fā)揮重要作用，其中SOD、CAT和GSH-px是評(píng)價(jià)機(jī)體氧化應(yīng)激水平的良好指標(biāo)，SOD是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要抗氧化酶，能保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[25]；CAT是一類氧化還原酶，可以催化過(guò)氧化氫分解無(wú)毒的分子氧和水，減少細(xì)胞氧化損傷；GSH-px 對(duì)催化還原型谷胱甘肽具有特異性，能夠保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及其功能[26-27]。研究表明，羥基紅花黃色素A可保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受炎癥損傷[28]，但其對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷的影響國(guó)內(nèi)外研究較少，具體機(jī)制也未闡明。因此，本課題組利用TNF-α刺激EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞模擬細(xì)胞損傷環(huán)境，進(jìn)一步詳細(xì)地研究羥基紅花黃色素A的抗炎與抗氧化活性及其作用機(jī)制。結(jié)果顯示，羥基紅花黃色素A能夠保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡，降低炎癥因子E-selectin、ICAM-1、VCAM-1以及趨化因子MCP-1的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)SOD、CAT、GSH-px的mRNA表達(dá)量，說(shuō)明羥基紅花黃色素A能夠減輕TNF-α誘導(dǎo)的炎癥損傷和過(guò)氧化損傷，提高機(jī)體抗炎和抗氧化能力。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB存在于體內(nèi)多種細(xì)胞中，是介導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)中心[29]。研究表明，抑制NF-κB可調(diào)節(jié)心肌損傷后TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎癥因子的表達(dá)，顯著抑制心肌炎癥反應(yīng)，從而減少心肌損傷[30]。報(bào)道顯示，NF-κB是活性氧誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣炎癥反應(yīng)的介導(dǎo)劑，并參與到炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中[31]。由于IκB-α與NF-κB P65/P50會(huì)形成細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物，以防止其核移位，因此，抑制 NF-κB 信號(hào)通路激活的關(guān)鍵步驟之一是抑制IκB-α的磷酸化和降解。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，羥基紅花黃色素A預(yù)處理的細(xì)胞在蛋白水平上表現(xiàn)出減少IκB-α的磷酸化和降解，從而阻止P65/P50向核移位。

綜上所述，TNF-α可誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，而活血化瘀中藥紅花的關(guān)鍵活性成分羥基紅花黃色素A能夠增加 NO含量，抑制ET-1表達(dá)，改善內(nèi)皮功能障礙，減少E-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)，增強(qiáng)SOD、CAT、GSH-px的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，且其抗炎活性及抗氧化能力可能與 NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。本研究可能為中醫(yī)藥干預(yù)心肌缺血性心血管疾病提供新的見(jiàn)解，有助于未來(lái)心血管疾病的防治。