李?lèi)倢?，肖柯心，趙冰潔，李紅玉，王 番，詹 博，賈艷艷

(1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710032；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046)

藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury，DILI)是指人體在用藥期間由于藥物本身或其代謝產(chǎn)物所引起的肝功能異常，大多數(shù)是由各種原因引起體內(nèi)CYP450酶活性降低或失活導(dǎo)致藥物在體內(nèi)蓄積所誘導(dǎo)的肝臟損傷[1-3]。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來(lái)DILI作為常見(jiàn)的藥物不良反應(yīng)之一，占?xì)W美急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)病例的7%～15%[4]，而在我國(guó)普通人群中的年發(fā)病率略高于西方國(guó)家并呈現(xiàn)逐年增高趨勢(shì)[5-7]。此外，在引起DILI的藥物中，部分營(yíng)養(yǎng)膳食補(bǔ)充劑、抗結(jié)核藥物、非甾體解熱鎮(zhèn)痛藥、抗腫瘤藥物、激素類(lèi)藥物等排名靠前[8]。對(duì)乙酰氨基酚(APAP)作為臨床中常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，目前已成為全球，尤其歐美等部分發(fā)達(dá)國(guó)家導(dǎo)致急性肝衰竭的首要病因，占ALF病例的50%左右[9]，嚴(yán)重影響人們的正常生活。近年來(lái)對(duì)DILI的治療一般采取抗炎抗氧化的保肝治療以及免疫調(diào)節(jié)治療等， N-乙酰半胱氨酸(NAC)是目前治療APAP所致藥物性肝損傷的首選藥物[10]，但又因其本身不可避免的不良反應(yīng)，尋求新的治療藥物仍迫在眉睫。

桑玉膏是空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院的中藥協(xié)定處方，主要選取玉竹、桑葚、黃精、薏苡仁、酸棗仁、枳椇子、梔子七味生藥，諸藥合用可補(bǔ)益肝腎，健脾益氣，除煩安神，改善肝炎等各種臨床癥狀或體征，具有疏肝保肝之功效。其中玉竹為君藥，具有養(yǎng)陰潤(rùn)燥，生津止渴，清肝明目的作用；黃精補(bǔ)氣養(yǎng)陰潤(rùn)肺，健脾益腎；桑葚、黃精、薏苡仁三藥合用能健脾益氣，兼補(bǔ)益肝腎，為臣藥；酸棗仁、枳椇子、梔子等共起養(yǎng)心安神，清肝除煩的作用，為佐使藥。臨床上顯示，桑玉膏可調(diào)節(jié)因肝火旺盛引起的易怒易躁、失眠多夢(mèng)等，同時(shí)也可改善因不同原因引起的各類(lèi)肝臟炎癥狀態(tài)，但具體作用機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)選用APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷小鼠模型，研究桑玉膏對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)作用及作用機(jī)制，以期為其臨床治療肝病提供現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取60只健康雄性昆明種小鼠，SPF級(jí)，體重18～20 g，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SYXK(陜)2019-001]。本實(shí)驗(yàn)已獲空軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)，實(shí)驗(yàn)期間均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的各項(xiàng)管理規(guī)范要求和使用原則。

1.1.2 藥品與試劑：桑玉膏由空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供(批號(hào)20220312)；N-(4-羥基苯基)乙酰胺(對(duì)乙酰氨基酚，APAP)(批號(hào)20220211)；NAC(批號(hào)20220110)購(gòu)自于碧云天生物技術(shù)公司，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)試盒(批號(hào)20220511)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)試盒(批號(hào)20220511)、堿性磷酸酶(ALP)酶測(cè)試盒(批號(hào)20220511)、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒(批號(hào)20220325)、丙二醛(MDA)測(cè)試盒(批號(hào)20220325)、一氧化氮(NO)測(cè)試盒(批號(hào)20220611)等均采購(gòu)于南京建成生物工程研究所，其余試劑均為分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：Spectra Max Pius3連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀(香港分子儀器公司)；5810R大型高速冷凍離心機(jī)(艾本德中國(guó)有限公司)、Milli-Q 純水儀(Millipore公司)、實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)儀器(Stepone plus，Applied Bio-systems)、KS 3000 ic control恒溫?fù)u床(德國(guó)IKA公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥液制備：桑玉膏按人體劑量換算為小鼠劑量(小鼠劑量為人體劑量的9.01倍)，采用無(wú)菌PBS溶解，分別配制成濃度為45.05、90.10、180.20 mg/ml的低、中、高劑量溶液用于小鼠灌胃；NAC采用無(wú)菌PBS溶解，配制成濃度為20 mg/ml溶液用于小鼠灌胃；APAP采用無(wú)菌PBS溶解，配制成15 mg/ml溶液用于小鼠腹腔注射。

1.2.2 動(dòng)物分組及造模給藥:健康雄性昆明種小鼠60只，5～7周齡，SPF 級(jí)，體重 18～20 g。飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜時(shí)間1∶1交替循環(huán)，保持室內(nèi)濕度45%～65%，室溫(22±3)℃，所有小鼠自由活動(dòng)，均提供正常飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為空白對(duì)照組、APAP模型組、NAC陽(yáng)性藥物組和桑玉膏低、中、高劑量組(225、450、900 mg/kg)每組10只。造模前所有小鼠均禁食不禁水飼養(yǎng)12 h，空白對(duì)照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，其余各組按不同體重腹腔注射相應(yīng)體積的APAP溶液(265 mg/kg)，測(cè)定AST和ALT的活性，與空白對(duì)照組比較，兩者升高則判定造模成功[11]。APAP模型制備完成后，各組小鼠均進(jìn)行治療性給藥，每天給藥1次，灌胃體積為10 ml/kg，空白對(duì)照組和APAP模型組灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液，NAC組灌胃等體積的NAC溶液(200 mg/kg)，桑玉膏低、中、高劑量組分別灌胃桑玉膏225、450、900 mg/kg，連續(xù)給藥5 d，末次給藥后禁食不禁水12 h，腹腔主動(dòng)脈取血，4 ℃ 3500 r/min離心15 min后收集血清，并解剖分離肝臟，檢測(cè)各項(xiàng)生化指標(biāo)。

1.2.3 小鼠肝功能檢測(cè)：小鼠腹腔主動(dòng)脈取血，血液置于1.5 ml EP管中并在室溫條件下靜置1 h，4 ℃ 3500 r/min離心15 min，分離血清，采用AST、ALT、ALP測(cè)定試劑盒檢測(cè)AST、ALT、ALP水平。

1.2.4 其他各項(xiàng)生化指標(biāo)測(cè)定：4 ℃ 3500 r/min離心15 min，分離血清，使用ELISA法檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、重組人白細(xì)胞介素-1β (IL-1β)水平含量；迅速分離肝臟，用PBS清洗掉表面浮血等雜質(zhì)后，計(jì)算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=(肝臟重量/體重)×100%，按測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)要求取部分新鮮肝臟用0.9%氯化鈉溶液制備肝組織勻漿，離心得肝勻漿上清液檢測(cè)SOD、MDA、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活性及NO含量。

1.2.5 qRT-PCR 法檢測(cè)小鼠肝臟組織中Bax、Bcl-2的表達(dá)：采用TRIzol試劑盒從研磨后的冷凍小鼠肝臟組織中提取總RNA后按照相關(guān)cDNA合成試劑盒說(shuō)明合成cDNA，接著對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)由南京金斯瑞科技有限公司完成，見(jiàn)表1。所得數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 肝組織病理學(xué)觀察：摘取小鼠右下葉少許肝臟組織固定在10%甲醛溶液中，24 h后用石蠟包埋制作病理切片，采取HE染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肝組織病理學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行組間比較;P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 基因擴(kuò)增引物信息

2 結(jié) 果

2.1 桑玉膏對(duì)APAP肝損傷小鼠肝臟指數(shù)以及血清中AST、ALT及ALP活性的影響 見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組比較，APAP模型組小鼠血清AST、ALT、ALP以及肝臟指數(shù)均明顯升高(P<0.01)。與APAP模型組比較，NAC陽(yáng)性藥物組及桑玉膏低、中、高劑量組的AST、ALT、ALP活性和肝臟指數(shù)均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 桑玉膏對(duì)APAP肝損傷小鼠肝臟指數(shù)及血清AST、ALT和ALP活性的影響

2.2 桑玉膏對(duì)APAP肝損傷小鼠組織SOD、MDA、GSH-PX、NO的影響 見(jiàn)表3。與空白對(duì)照組比較，APAP模型組小鼠肝組織SOD、GSH-PX活性均顯著降低(P<0.01)，MDA活性和NO含量顯著升高(P<0.01)；與APAP模型組比較，NAC陽(yáng)性藥物組及桑玉膏低、中、高劑量組SOD、GSH-PX活性均顯著升高(P<0.01)，MDA活性和NO含量均顯著降低(P<0.01)。

表3 桑玉膏對(duì)APAP肝損傷小鼠SOD、MDA、GSH-PX、NO的影響

2.3 桑玉膏對(duì)APAP肝損傷小鼠血清TNF-α、IL-1β的影響 見(jiàn)表4。與空白對(duì)照組比較，APAP模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β含量均顯著升高(P<0.01)；與APAP模型組比較，NAC陽(yáng)性藥物組和桑玉膏低、中、高劑量組TNF-α和IL-1β含量均顯著降低(P<0.01)。

2.4 桑玉膏對(duì)APAP肝損傷小鼠肝臟組織中Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)表5。與空白對(duì)照組比較，APAP模型組小鼠肝臟組織中Bax的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)，Bcl-2的mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.01)；與APAP模型組比較，NAC陽(yáng)性藥物組和桑玉膏低、中、高劑量組小鼠肝臟組織中Bax的mRNA表達(dá)均顯著下降(P<0.01)，Bcl-2的mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.01)。

表4 桑玉膏對(duì)APAP肝損傷小鼠血清TNF-α、IL-1β的影響(pg/ml)

2.5 桑玉膏對(duì)APAP肝損傷小鼠肝組織病理學(xué)的影響 在顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；APAP模型組肝損傷小鼠肝細(xì)胞體積增大，可見(jiàn)到不同程度的點(diǎn)狀壞死灶和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)匯管周?chē)?xì)胞分界模糊，裂解嚴(yán)重。給予桑玉膏干預(yù)后，各組均能有效減輕肝細(xì)胞腫脹程度，點(diǎn)狀壞死灶面積減少，有效改善肝細(xì)胞損傷(圖1)。

表5 桑玉膏對(duì)APAP肝損傷小鼠肝臟組織中Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

A：空白對(duì)照組；B：APAP模型組；C：NAC陽(yáng)性藥物組；D：桑玉膏低劑量組；

3 討 論

中醫(yī)藥對(duì)DILI的治療歷史悠久，DILI的病位屬肝，多數(shù)皆因用藥不當(dāng)后的藥物毒性所引起。歷代醫(yī)家普遍認(rèn)為DILI與感受時(shí)邪、久病體虛等密切相關(guān)，而肝失疏泄是關(guān)鍵病機(jī)之一[12-14]。肝臟是人體最大的代謝器官，主疏泄，疏泄正常，則人體氣機(jī)通暢，脾胃運(yùn)轉(zhuǎn)自如，面色紅潤(rùn)，反之，則氣機(jī)不暢，脾失健運(yùn)，氣血虧虛，形成瘀血，為脅痛。有研究表明， DILI一般分為劑量依賴性的直接藥物性肝損傷與特異質(zhì)型藥物性肝損傷，直接藥物性肝損傷指在藥物使用后，其藥物本身或相關(guān)代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟細(xì)胞造成的直接損傷，大多與藥物使用劑量有關(guān)[15-18]。APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷屬直接藥物性肝損傷，免疫系統(tǒng)紊亂和細(xì)胞氧化應(yīng)激是其主要機(jī)制之一[19-22]。臨床實(shí)踐證明，中醫(yī)藥具有不良反應(yīng)小、性質(zhì)溫和等優(yōu)點(diǎn)，且部分中醫(yī)藥對(duì)DILI的治療效果顯著，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。唐文誠(chéng)等[23]建立小鼠APAP急性肝損傷模型，通過(guò)枳椇水提物4 d的灌胃治療發(fā)現(xiàn)，枳椇水提物單方可明顯改善APAP造成的肝臟損傷，但使用過(guò)久難免產(chǎn)生相應(yīng)不良反應(yīng)。桑玉膏作為一款藥食同源的中藥復(fù)方，含枳椇子、薏苡仁、桑葚等多種成分，其中不同組分以有效配伍的方式發(fā)揮作用，不簡(jiǎn)單作用于機(jī)體某個(gè)確定的靶點(diǎn)。基于此，本實(shí)驗(yàn)選用ALT、AST、ALP、MDA、NO、GSH-PX、促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2等指標(biāo)以及肝組織病理學(xué)評(píng)價(jià)桑玉膏對(duì)APAP所致肝損傷的保護(hù)作用及相關(guān)作用機(jī)制。結(jié)果顯示，桑玉膏低、中、高劑量組均能不同程度緩解APAP導(dǎo)致的小鼠肝組織病理改變和炎癥狀態(tài)，同時(shí)桑玉膏各劑量組可顯著降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，上調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，且高劑量效果最為明顯，說(shuō)明桑玉膏能有效緩解APAP引起的肝損傷。此研究發(fā)現(xiàn)APAP所致肝損傷能刺激小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-1β炎癥因子在細(xì)胞中表達(dá)增多，造成免疫系統(tǒng)紊亂，但經(jīng)桑玉膏干預(yù)后，TNF-α、IL-1β的表達(dá)顯著減少，提示桑玉膏緩解APAP所致的肝損傷可能是通過(guò)減輕其炎癥反應(yīng)來(lái)達(dá)到治療效果，與免疫反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān)。

綜上所述，桑玉膏可能通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力，加快體內(nèi)活性氧的清除，同時(shí)抑制炎癥因子應(yīng)答，減緩炎癥發(fā)生從而起到保護(hù)APAP模型小鼠肝臟的作用。