陳思思，王俊，鄭杭生

(1.浙江省湖州市第三人民醫(yī)院藥劑科，湖州 313000；2.浙江中醫(yī)藥大學藥學院，杭州 310000)

三七總皂苷(Panaxnotoginsengsaponins，PNS)是中藥三七的主要有效成分，包含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1等單體成分[1-2]，PNS具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和降血脂等作用[3-5]。臨床上廣泛用于治療心腦血管疾病(包括急性腦梗死、阿爾茨海默病、急性心肌梗死、高脂血癥等)，骨科疾病(包括膝骨關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎、強直性脊柱炎等)和慢性阻塞性肺疾病等[6]。

目前，PNS在臨床的應用多為注射劑與口服制劑。因注射劑安全性低及患者自給藥不便，口服制劑生物利用度不高、胃腸道的刺激性而限制其使用。經(jīng)皮給藥具有避免首關效應、安全性好、血藥濃度更平穩(wěn)等優(yōu)點，尤其適用于局部治療給藥(如軟組織損傷、骨折等)。前期，本課題組通過皮膚外用PNS經(jīng)皮給藥制劑對大鼠急性軟組織損傷具有良好的治療作用[7]，本研究將建立超高效液相色譜法(ultra high performance liquid chromatography，UPLC)測定外用三七總皂苷傳遞體噴霧劑后大鼠皮膚中4種皂苷成分(三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1)的含量，為后期進行制劑的作用機制研究提供科學高效的檢測方法。

1 儀器與材料

1.1儀器 超高效液相色譜儀：Acquity UPLC(美國Waters公司，二元泵，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器)；MSE3.6P-0CE-DM型電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司，感量：0.001 mg)；低速離心機(上海安亭科學儀器公司)；R-502旋轉蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術有限公司)；Q501恒溫水浴鍋(鞏義市英峪高科儀器廠)；HOMOEX-25高壓膜擠出器(上海赫默仕機電科技有限公司)；聚碳酸酯徑跡蝕刻膜(型號：0.05，0.1 μm，英國Whatman公司)；XL2000超聲破碎儀(美國Misonix公司)；Nano-ZS90激光粒徑儀(英國Malvern公司)；噴霧瓶(杭州賓達包裝材料有限公司)。

1.2試藥 三七總皂苷(陜西森朗生物化工有限公司，批號：TB20201210，含量>95%)；對照品：三七皂苷R1(批號：110745-201921，含量以90.4%計)、人參皂苷Rg1(批號：110703-202034，含量以94.0%計)、人參皂苷Re(批號：110754-202028，含量以93.9%計)、人參皂苷Rb1(批號：110704-202028，含量以93.1%計)，均由中國食品藥品檢定研究院提供；大豆磷脂(注射級，上海太偉藥業(yè)股份有限公司，批號：202007022，含量≥70%)；高純膽固醇(注射級，艾偉拓上海醫(yī)藥科技有限公司，批號：B90867)；檸檬烯(批號：20200916，含量≥95%)、檸檬醛(批號：20201009，含量≥96%)、維生素E(批號：20201118，含量≥98%)，由江西源上草香料有限公司提供；乙腈為色譜純(美國Honeywell公司)；甲醇、丙酮為分析純(天津永大化學試劑有限公司)；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.3動物 清潔級雄性SD大鼠，體質量(180±20) g，由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(浙)2019-0002。飼養(yǎng)于普通級環(huán)境，室溫15～30 ℃，相對濕度30%～75%，單籠普通飼料喂養(yǎng)，自由飲用純凈水。

2 方法與結果

2.1對照品溶液的制備 分別精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1對照品適量，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶液定容，搖勻，得混合對照品儲備液，其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1濃度分別為0.104，0.426，0.058，0.452 mg·mL-1。

2.2色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫：0～8 min，19% → 25% A；8～9 min，25% → 42% A；9～12 min，42%→55% A；體積流速：0.5 mL·min-1；檢測波長：203 nm；進樣量：1 μL，柱溫：30 ℃。

2.3三七總皂苷傳遞體(脂質體)噴霧劑的制備 按前期優(yōu)化的處方工藝制備三七總皂苷傳遞體[7]：稱取三七總皂苷100 mg、高純膽固醇15 mg、大豆磷脂120 mg、維生素E 2 mg、中藥揮發(fā)油(檸檬烯：檸檬醛= 4：1)80 mg，溶于甲醇：二氯甲烷(3：4)混合溶劑35 mL中，轉移至500 mL茄形瓶中，在避光、45 ℃、50 r·min-1下減壓旋轉蒸發(fā)去除溶劑，得到干膜，繼續(xù)旋轉蒸發(fā)2 h以確保有機溶劑除盡，加入10 mL水化液[磷酸鹽緩沖液(PBS)，pH值為5.0，相對離子濃度為1/10]，振搖至水化完全，放置過夜后進行超聲破碎處理(溫度為25 ℃，功率為19 W，時間為1 min，開5 s，關5 s)，并將傳遞體混懸液在40 ℃水浴、氮氣壓條件下依次擠壓通過100 nm與50 nm孔徑的聚碳酸酯徑跡蝕刻膜(擠出壓力分別為0.25，0.49 MPa)，即得三七總皂苷傳遞體，裝入噴霧瓶中得噴霧劑。三七總皂苷脂質體噴霧劑的制備是在上述處方工藝基礎上去除中藥揮發(fā)油成分，其余制備工藝相同。

2.4給藥 取健康SD大鼠(雄性)，乙醚麻醉后固定于鼠板上，用剃毛器小心剔除腹部毛發(fā)，并用彎剪進行修理，在修理后的腹部皮膚上給予三七總皂苷傳遞體噴霧劑(三七總皂苷含量為5 mg)0.5 mL，給藥面積為2 cm2。

2.5皮膚樣品的制備與處理

2.5.1空白皮膚的制備 取正常大鼠，用過量乙醚麻醉致死，固定于鼠板上，用剃毛器和彎剪去除大鼠胸骨至腹部的毛發(fā)，取下腹部皮膚并去除皮下組織(確保不破壞皮膚角質層)，用0.9%氯化鈉溶液進行清洗，吸干水分，用錫箔紙包裹后置于-70 ℃冰箱保存，備用。

2.5.2空白皮膚樣品的處理 參照文獻[8]方法。取“2.5.1”項下大鼠離體皮膚，室溫解凍，剪取1 cm2大小，置于研磨器中，加入0.9%氯化鈉溶液200 μL，充分研磨，得皮膚勻漿：將提取溶劑(丙酮：甲醇 = 3：1)3 mL加入皮膚勻漿中，渦旋2 min，于2000 r·min-1離心15 min(離心半徑25 cm，相對離心力為1119×g)后，取上清液，重復提取2次，合并提取液至具塞塑料離心管中，60 ℃下氮氣流吹干，殘留物用甲醇50 μL溶解，離心后取上清液1 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣分析。

2.5.3用藥后皮膚樣品的處理 按“2.4”項下進行皮膚給藥，一段時間后用過量乙醚麻醉大鼠致死，按“2.5.1”項下方法取下給藥部位皮膚，用0.9%氯化鈉溶液沖洗皮膚表面未被吸收的藥物，吸干多余水分，按“2.5.2”項下進行皮膚樣品處理后按“2.2”項下色譜條件進樣分析。

2.6方法學考察

2.6.1標準曲線的繪制 取“2.5.1”項下空白皮膚，室溫解凍，剪取1 cm2大小，置于研磨器中，分別加入“2.1”項下混合對照品儲備液2，4，10，25，50，75，100，200 μL，按“2.5.2”項下進行皮膚樣品處理，按“2.2”項色譜條件進樣分析。以峰面積(Y)對含量(X)進行線性回歸，結果見表1，由此可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 4種成分線性關系

2.6.2專屬性考察 取“2.5”項下空白皮膚、給藥后的皮膚及空白皮膚加對照品溶液，按“2.5”項下進行處理，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，結果見圖1。由圖可見，該方法專屬性良好。

A.空白皮膚；B.空白皮膚+混合對照品溶液；C.給藥后的皮膚；1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Re；4.人參皂苷Rb1。

2.6.3精密度與準確度實驗 取“2.5.1”項下空白皮膚，室溫解凍，剪取1 cm2大小，置于研磨器中，加入低、中、高3個濃度的混合對照品溶液(其中三七皂苷R1含量依次為0.42，5.20，20.80 μg；人參皂苷Rg1含量依次為1.70，21.30，85.20 μg；人參皂苷Re含量依次為0.23，2.90，11.60 μg；人參皂苷Rb1含量依次為1.81，22.6，90.40 μg)，按“2.5.2”項下進行處理，于1 d內連續(xù)測定6次，得日內精密度；于連續(xù)6 d內各測1次，得日間精密度；同時測定準確度，結果見表2。結果表明，該方法具有良好的精密度與準確度。

表2 4種成分精密度與準確度實驗結果

2.6.4提取回收率實驗 取“2.5.1”項下空白皮膚，室溫解凍，剪取1 cm2大小，置于研磨器中，先加入低、中、高3個濃度的混合對照品溶液，按“2.5.2”項下進行處理，重復3次；另取1 cm2大小空白皮膚，按“2.5.2”項下方法操作，在加入提取溶劑的時，加入對應濃度對照品溶液，其他步驟不變，重復3次。測得提取回收率為90.31%～102.70%，符合生物樣本含量測定要求。

2.6.5穩(wěn)定性實驗 取空白皮膚，室溫解凍，剪取1 cm2大小，置于研磨器中，加入低、中、高3個濃度的混合對照品溶液，按“2.5.2”項下進行處理，制成質控樣品，測得的濃度定為初始參比值，分別將上述樣品于室溫放置24 h、-20 ℃反復凍融3次、-20 ℃冷凍保存30 d條件下平行測定3份樣品，將所得濃度與初始值相比，考察樣品在室溫、凍融循環(huán)和冷凍條件下的穩(wěn)定性，結果見表3。結果表明，樣品溶液穩(wěn)定性良好。

表3 4種成分穩(wěn)定性實驗結果

2.7皮膚中藥物滯留含量測定 按“2.3”項下方法制備三七總皂苷傳遞體噴霧劑和三七總皂苷脂質體噴霧劑，按“2.4”項下給藥。12 h后按“2.5.3”項下方法取下含藥皮膚，分為兩等份，其中一份用膠帶黏貼角質層側皮膚，重復20次，得去角質層皮膚，用于測定角質層下皮膚藥物滯留量；另一份不做處理，用于測定全皮藥物滯留量，兩者差值即為角質層中的藥物滯留量。按“2.5.3”項下方法處理，進樣分析，結果見表4。結果表明，兩種不同制劑應用12 h后，其中，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re在全皮與角質層下皮膚中的滯留量均為三七總皂苷脂質體噴霧劑>三七總皂苷傳遞體噴霧劑，而人參皂苷Rb1則恰好相反。此外，通過計算全皮與角質層下皮膚中藥物滯留量的差值可以看出三七總皂苷脂質體噴霧劑中各成分在角質層的滯留量大于三七總皂苷傳遞體噴霧劑。

表4 4種成分皮膚滯留量測定結果

3 討論

對于皮膚樣品前處理方式的選擇：對比化學方式(強腐蝕性的高氯酸)與物理方式(手動研磨成勻漿)后發(fā)現(xiàn)，雖然化學方式能較大的節(jié)約人力與時間，但相比物理方式，該方法的藥物提取回收率明顯降低，說明化學方式可能對藥物穩(wěn)定性影響較大，故本實驗采用物理方式進行皮膚樣品前處理。對于柱溫與體積流量的選擇：對比25，30，35 ℃ 3種柱溫及0.4，0.5，0.6 mL·min-13種體積流量，發(fā)現(xiàn)在30 ℃柱溫和0.5 mL·min-1體積流量條件下人參皂苷Rg1和人參皂苷Re 2個相鄰成分以及人參皂苷Rb1與雜質峰的分離度較好。

本課題組前期采用高效液相色譜法(HPLC)進行大鼠皮膚中三七皂苷R1和人參皂苷Rb1的含量測定[8]，采用乙腈和水為流動相進行梯度洗脫，但該分析方法存在耗時久(分析時間> 60 min)、流動相消耗大等問題。同時，本課題組發(fā)現(xiàn)采用HPLC法同時測定多種皂苷成分時并不能將人參皂苷Rg1和人參皂苷Re這兩個相鄰的色譜峰完全分離。通過本研究所建立的UPLC法能夠同時測定大鼠皮膚中4種皂苷成分的含量，該方法相比HPLC法具有更好的分離度與靈敏度，且分析時間大大縮短[9-11]，能夠在保證準確性的同時有效提高檢測效率。

此外，本研究利用UPLC法對2種不同制劑(三七總皂苷傳遞體噴霧劑與三七總皂苷脂質體噴霧劑)中4種皂苷成分的皮膚滯留特性進行初步探究。通過比較2種制劑中4種皂苷成分在大鼠皮膚不同部位中的滯留量，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷脂質體噴霧劑中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re在大鼠皮膚中(尤其是角質層中)的滯留量較大，這一結果符合這兩種載體的皮膚轉運機制(即傳遞體由于其自身良好的變形性能，通過誘導皮膚屏障中水性通道擴張，再加上利用皮膚水化梯度形成的滲透力使其能夠完整的穿過皮膚屏障；而脂質體僅僅依靠單純的膜間轉運形式促使藥物透過皮膚，這就使得大量藥物難以透過皮膚角質層而滯留于其中；而人參皂苷Rb1成分在大鼠皮膚中的滯留情況則與上述3種成分相反，這一點與本課題組的部分前期研究結果相一致[8]，推測可能是由于該成分本身結構的特殊性所造成，具體原因有待進一步的研究。

本研究建立檢測方法經(jīng)濟、高效、準確，可為后期進行三七總皂苷相關制劑皮膚滲透、滯留機制的研究奠定良好基礎。