夏 楊， 徐 彬， 李傳明，， 劉 琴，， 韓光杰， 黃立鑫， 祁建杭， 陸玉榮， 徐 健

(1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/國家農(nóng)業(yè)微生物揚州觀測實驗站，江蘇揚州 225007； 2.揚州綠源生物化工有限公司，江蘇揚州 225008)

植物內(nèi)生菌(endophyte)是一定階段或全部階段生活于健康植物的組織、器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙的真菌、細(xì)菌或放線菌[1]。內(nèi)生菌長期定殖在植物體內(nèi)，通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號傳導(dǎo)作用于植物體產(chǎn)生影響，產(chǎn)生酶、激素、拮抗物質(zhì)等來改善植物對非生物脅迫(干旱、鹽脅迫等)和生物脅迫(病原物、害蟲等)的耐受性[2]。梨形孢屬擔(dān)子菌門(Basidiomycota)層菌綱(Hymenomycetes)蠟殼耳目(Sebacinales)蠟殼耳科(Sebacinaceae)梨形孢屬(Piriformospora)，是一類最早分化的擔(dān)子門菌根菌，長期定殖存活在植物根系。1998年首次從沙漠灌木根際分離獲得P.indica菌株[3]，2012年在德國分離鑒定P.williamsii菌株[4]。大量研究證明，印度梨形孢寄主范圍廣泛，可以與200多種單子葉、雙子葉植物共生[5]，通過增強植物對N、P等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)植物生長，增強植物系統(tǒng)抗性，是一種具有廣泛應(yīng)用潛力的多功能植物內(nèi)生真菌[6-7]。

植物內(nèi)生菌系統(tǒng)分布于植物的根、莖、葉、花、果實等器官和組織的細(xì)胞或細(xì)胞間隙，其種類、分布、定殖因植物種類及定殖部位不同而異[8]。不同于單細(xì)胞的內(nèi)生細(xì)菌，印度梨形孢僅定殖于植物根系表面、表皮細(xì)胞和細(xì)胞間隙，并形成典型的梨形厚垣孢子，長期定殖存活在作物根系[9]。根系皮層梨形厚垣孢子的染色觀察成為檢測印度梨形孢在寄主植物上定殖共生的直接證據(jù)[10-12]。這種定性判別往往會受到取樣組織差異、雜質(zhì)污染等外部因素影響?；贓F1α基因的PCR擴(kuò)增檢測技術(shù)靈敏度較低，無法檢測出低拷貝模板DNA。綠色熒光蛋白標(biāo)記法[13]可以對定殖部位和密度進(jìn)行實時動態(tài)觀測，但此法必須以獲得綠色熒光蛋白標(biāo)記突變株為前提且外源基因的引入可能會使其生物學(xué)效應(yīng)降低。實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，簡稱qPCR)作為一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的技術(shù)，已在病原體檢測[14]、基因表達(dá)量分析[15]、臨床疾病診斷[16]等方面得到了廣泛應(yīng)用。本研究旨建立一種快速靈敏、準(zhǔn)確高效的P.indica定殖定量的qPCR檢測方法，為深度開展印度梨形孢與寄主作物互作研究提供科學(xué)、準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

供試P.indica菌株P(guān)I-020由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所分離和保存。參考舒珊等的培養(yǎng)方法[17]，取PI-020于PDA平板上活化，28 ℃培養(yǎng)5 d后，截取邊緣活性菌絲塊接種PDB培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，勻漿后獲得孢子懸液。

供試水稻品種為南粳9108。2021年12月于室內(nèi)將水稻種子漂洗、70%乙醇浸泡5 min、1%次氯酸鈉溶液浸泡5 min表面消毒后，無菌水沖洗3次并浸種1 d，28 ℃黑暗條件下催芽3 d。

挑選長勢一致的萌發(fā)種子置培養(yǎng)皿中，加入含PI-020(濃度為5×104CFU/mL)的營養(yǎng)液[18]，以不含PI-020的營養(yǎng)液處理為對照組，于晝溫 30 ℃、夜溫26 ℃、光—暗周期14 h—10 h、相對濕度70%的條件下培養(yǎng)，每2 d更換1次營養(yǎng)液。分別于培養(yǎng)3、5、7、9、11、13 d取樣截取根部組織，每個時間點取樣10株，試驗設(shè)置3個重復(fù)。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取P.indica樣品準(zhǔn)備：PI-020于PDA平板上進(jìn)行活化，28 ℃培養(yǎng)5 d，刮取菌絲，液氮研磨；根系樣品準(zhǔn)備：根系樣品10%甲醛浸泡 10 min，無菌水沖洗3次后晾干，液氮研磨?；蚪MDNA提取均采用CTAB(源葉生物，中國)法[19]，采用NanoPhotometer N50(IMPLEN，德國)檢測DNA濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 根據(jù)P.indicaEF1α基因序列[20]，參考Lin等的設(shè)計引物[21]Pi-F：5′-T C C G T C G C G C A C C A T T-3′，Pi-R：5′-A A A T C G C C C T C T T T C C A C A A-3′，利用NCBI的Primer-BLAST 工具完成對引物的特異性檢測。以P.indica基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min。采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并克隆至pCE2-TA/Blunt-Zero(諾唯贊，中國)載體上，獲得的重組質(zhì)粒pCE2-Pi，作為qPCR擴(kuò)增的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為90 ng/μL)，根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)計算公式，換算成拷貝數(shù)為2.03×1010copies/μL。

1.2.3 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度檢測 對上述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pCE2-Pi進(jìn)行10倍梯度稀釋，備用。利用StepOnePlus實時熒光定量PCR儀(ABI，美國)，以2.03×107～2.03×102copies/μL共6個濃度梯度的pCE2-Pi質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為2×ChamQ SYBR qPCR Green Master Mix 10 μL，50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，CT值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，比較qPCR檢測的靈敏度。

1.2.4 水稻苗根系P.indica的定殖檢測 參考袁聽等的臺盼藍(lán)染色法[10]對定殖培養(yǎng)水稻根系樣品進(jìn)行染色、鏡檢觀察。同時，以無菌水作為稀釋液，將提取的水稻根系樣品DNA稀釋至相同濃度(50 ng/μL)，利用常規(guī)PCR法[21]以及上述已建立的qPCR方法，對樣品DNA進(jìn)行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 22軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和F檢驗(Tukey’s檢驗)，利用Microsoft Excel 2019、GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物檢測及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

基于P.indicaEF1α基因的序列，通過引物 Pi-F/Pi-R對P.indica基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了大小為84 bp的目的片段(圖1)。利用該引物對實驗室常備材料水稻、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、灰梨孢(Pyriculariaoryae)、婁徹氏鏈霉菌(Streptomycesrochei)等DNA進(jìn)行擴(kuò)增，均未檢測到目標(biāo)條帶(圖略)，表明所設(shè)計的引物特異性較好。目的片段經(jīng)切膠回收，連接至pCE2-TA/Blunt-Zero載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，所得轉(zhuǎn)化子通過菌液PCR鑒定，電泳獲得大小為250 bp的明亮單一條帶(圖2)，符合預(yù)期大小。目的片段經(jīng)測序鑒定正確，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度分析

以2.03×107～2.03×102copies/μL共6個濃度梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，獲得不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線(圖3-A)，當(dāng)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2.03×102copies/μL時， 仍有擴(kuò)增曲線。常規(guī)PCR結(jié)果表明，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為2.03×107～2.03×105copies/μL時，電泳有明顯條帶。當(dāng)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度小于2.03×105copies/μL時，電泳無條帶(圖3-B)，檢測靈敏度為2.03×105copies/μL。說明建立的qPCR法檢測靈敏度能達(dá)到2.03×102copies/μL，比常規(guī)PCR高1 000倍。根據(jù)qPCR擴(kuò)增結(jié)果，獲得不同起始模板所對應(yīng)的各自CT值。以起始模板對數(shù)為X軸、CT值為Y軸，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線表明，隨著樣品濃度的減小，CT值逐漸增加，兩者呈線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)r2=0.999，說明擬合的線性回歸方程效果較好。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=-3.945x+42.045(圖4)。

2.3 水稻苗根系P. indica定殖檢測

以染色法、常規(guī)PCR法、qPCR方法檢測水稻苗根系P.indica的定殖，比較不同檢測方法的差異。臺盼藍(lán)染色鏡檢P.indica處理水稻根系，僅在處理7 d的樣品部分根系直接觀察到經(jīng)染色后呈深藍(lán)色的厚垣孢子，對照未發(fā)現(xiàn)P.indica孢子定殖，說明染色鏡檢受取樣等因素影響大，不能準(zhǔn)確反映P.indica的實際定殖情況(圖5-A)。常規(guī)PCR檢測同樣是處理7 d的水稻根系樣品DNA能擴(kuò)增出 84 bp 的目的條帶，其余DNA均未擴(kuò)增出條帶(圖5-B)。采用qPCR法對水培水稻苗根系P.indica定殖量進(jìn)行檢測，所有樣本中均能檢測到P.indica，P.indica處理3 d即成功定殖于水稻苗根系，定殖量為5.54×102copies/μL，5 d上升至 6.62×102copies/μL，7 d顯著上升，達(dá)到最高定殖量1.51×104copies/μL(DNA)，隨后定殖量顯著下降，9 d定殖量為5.58×102copies/μL，13 d仍能檢測到5.58×102copies/μL的定殖量(圖5-C)。

3 討論

P.indica在植物根系穩(wěn)定定殖是其發(fā)揮功能多樣性的必要條件，開展高效精準(zhǔn)的P.indica定殖檢測是P.indica基礎(chǔ)研究工作中的重要環(huán)節(jié)。qPCR具有精準(zhǔn)定量、高效靈敏等優(yōu)點，可用于樣品中特定DNA序列的定性定量分析。李磊等基于立枯絲核菌融合群AG3的TEF保守區(qū)間設(shè)計特異性引物，建立的立枯絲核菌qPCR檢測體系靈敏度為19.5 fg/μL，是常規(guī)PCR的1 000倍[22]。Dubey等基于ITS序列同源性設(shè)計引物，用于番茄病原菌(立枯絲核菌)的檢測，其中常規(guī)PCR法檢測下限為0.025 ng/μL，而qPCR法檢測下限為1.24 pg/μL，靈敏度遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR法[23]。傳統(tǒng)的臺盼藍(lán)染色法雖然簡單、快捷、直觀、方便，目前作為主要的檢測方法應(yīng)用于P.indica定殖能力的檢測試驗[24-25]，但在進(jìn)行P.indica定殖檢測時，其結(jié)果的準(zhǔn)確度往往受根系取樣部位所影響，同時只能局部顯微鏡檢，不能全面反映內(nèi)生菌的定殖情況，影響了試驗的準(zhǔn)確性。盛萍萍等研究表明，染色前樣品根系的處理還應(yīng)控制好KOH溶液濃度和處理時間，主要由寄主作物種類及其木質(zhì)化程度所決定[26]。對于木質(zhì)化程度較低的草本植物幼嫩根系，過高濃度(>10%)的KOH溶液和過長(>60 min)的處理時間都會對根系皮層細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成破壞，染色后難以觀察和區(qū)分。因此，應(yīng)根據(jù)P.indica自身定殖特點結(jié)合寄主作物種類，選擇合適的部位(根系成熟區(qū))，運用恰當(dāng)?shù)奶幚矸绞竭M(jìn)行檢測，同時增加取樣范圍和頻次，以進(jìn)一步提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。常規(guī)PCR法雖然具有較高的靈敏度，但對于根系表面定殖數(shù)量相對較少的內(nèi)生菌而言，仍難以檢測到低拷貝數(shù)的DNA樣品，同時不能準(zhǔn)確統(tǒng)計定殖數(shù)量，分析定殖效應(yīng)。本研究所建立的P.indicaqPCR定殖定量檢測方法具有較高的擴(kuò)增特異性，能呈現(xiàn)出良好的“S”形擴(kuò)增曲線，基于起始模板對數(shù)與CT值所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，靈敏度能達(dá)到2.03×102copies/μL，比常規(guī)PCR提高1 000倍，因此可以很好地用于P.indica的定殖定量檢測。

4 結(jié)論

本研究建立了能夠快速、精準(zhǔn)、高效地對水稻根系P.indica定殖進(jìn)行定量檢測的qPCR方法，分析該方法相比于臺盼藍(lán)染色法和常規(guī)PCR法在準(zhǔn)確度和靈敏度上所表現(xiàn)出來的優(yōu)越性，為深度開展印度梨形孢與寄主作物互作研究提供科學(xué)、準(zhǔn)確的檢測方法。