肖曉梅， 丁 玲

(福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝園林學(xué)院，福建福州 350000)

細胞膜是參與細胞呼吸、光合作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程的半透性膜[6]，細胞膜的完整性和功能受脂質(zhì)組成和脂肪酸(FAs)飽和度的影響。在生物體中膜脂中的FAs主要分為飽和脂肪酸(SFA)和不飽和脂肪酸(UFA)。目前的研究表明，F(xiàn)As飽和度的特征、組成及變化與植物應(yīng)對脅迫的策略密切相關(guān)[7]。先前的研究表明，干旱脅迫下不同狗牙根草(CynodondactylonL.)的FAs特征變化不同，在耐旱品種中UFA含量波動較小，在敏感品種中UFA總量降低[8]；進一步研究發(fā)現(xiàn)敏感型狗牙根草中主要表現(xiàn)為亞油酸(C18：2)和亞麻酸(C18：3)減少，棕櫚酸(C16：0)和硬脂酸(C18：0)增加[9]。與此相反，在干旱環(huán)境中葡萄(Vitisvinifera)苗中以亞油酸(C18：2)為主的UFA含量增加，而以山崳酸(C22：0)為主的SFA整體降低[10]。以上研究表明，干旱脅迫下植物可通過調(diào)節(jié)FAs的組成特征以維持生物膜的完整性。

建蘭(Cymbidiumensifolium)為蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)多年生觀賞性草本植物，建蘭以其花姿優(yōu)美、葉藝俱佳、蘭香馥郁等特點深受人們喜愛[11]。然而在室內(nèi)栽培或野外自然生長過程中易受到干旱和地表高溫等影響，且建蘭對干旱環(huán)境極為敏感，當水分長期供應(yīng)不足時植株色澤暗淡甚至焦枯。蘭科菌根(ORM)是蘭科原球莖或成年植株根部與特定菌根真菌形成的一種共生結(jié)構(gòu)[12]，絕大部分蘭科植物必須通過ORM獲取養(yǎng)分資源才能正常生長；目前，發(fā)掘菌根真菌應(yīng)用于蘭花栽培已成為最具應(yīng)用前景的技術(shù)策略之一。本研究基于前期從建蘭根系分離得到的3種不同屬蘭科菌根真菌，且研究表明該3株菌株對建蘭(C.ensifolium)、硬葉蘭(C.mannii)和鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)生長具有良好的促進作用，但對于脅迫條件下蘭科的促生效果尚不清楚[11]；基于此，探索了菌根真菌對干旱脅迫下建蘭生理生化及脂肪酸組成的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2021年6—10月在福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝實驗室中進行。供試建蘭(Cymbidiumensifolium)品種為小桃紅，為標準的5 cm組培苗，來自福建農(nóng)林大學(xué)蘭科植物保護與利用重點試驗室。3株蘭科菌根真菌分別為膠膜菌(Tulasnellasp.)、角擔(dān)菌(Ceratobasidiumsp.)和蠟殼菌(Sebacinasp.)，均分離自建蘭根系，3株菌根真菌具體信息見文獻[11]，皆來自中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置培養(yǎng)水分含量為主處理，接種蘭科菌根真菌與否為次處理。次處理為：CK，不接種蘭科菌根真菌；CE，接種角擔(dān)菌；TU，接種膠膜菌株；SE，接種蠟殼菌；以上處理皆基于2個水分主處理：85%正常土壤含水率(WW)、土壤50%含水率的干旱處理(DS)，共8個處理組合。各處理重復(fù)5次。

試驗盆栽裝置為黑色圓錐形塑料桶，上口徑 18 cm、下口徑15 cm、盆高22 cm。每盆裝花卉培養(yǎng)基質(zhì)2.5 kg。菌株處理采用均勻灌根方式施入，CK處理則加入無菌培養(yǎng)液。按照上述處理設(shè)置土壤含水量，將1年生的建蘭植株轉(zhuǎn)移至相應(yīng)處理土壤基質(zhì)中。同時采用配備園藝型ML3探頭的HH-2 WET/WET-2-K1 Delta-T WET便攜式土壤水分儀(上海禾工科學(xué)儀器有限公司)監(jiān)測培養(yǎng)基質(zhì)含水率，采用自動滴灌方式補充水分。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 菌株重分離、抗氧化酶活性、應(yīng)激產(chǎn)物含量及水分利用參數(shù)測定 培養(yǎng)結(jié)束后，取建蘭接種菌株的植株和不接種處理各3株，挑選幼嫩根系采用0.1%的氯化汞(HgCl2)溶液進行表面消毒2 min，接著無菌水清洗3～5次；之后采用組織塊分離法進行菌根真菌的重分離，具體操作參照陳寶玲等的方法[13]。

1.3.2 根系脂肪酸成分及含量測定 脂肪酸(FAs)的測定參考GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》，采用氣相色譜-質(zhì)譜法測定。稱取-20 ℃保存的建蘭根系樣品50 mg、1% H2SO4和2 mL色譜級甲醇溶液加入到10 mL的PE試管中，在80 ℃下進行甲酯化反應(yīng)，后續(xù)加入1.0 mL正己烷和0.5 mL乙醚，用渦旋混勻器溶解混勻進行初步萃??；再加1.0 mL甲醇、1.0 mL氫氧化鉀-甲醇溶液(1 mol/L)。采用渦旋混勻器溶解混勻30 s，靜置10 min；采用去離子水進行洗滌，再轉(zhuǎn)移到2 mL自動進樣器中。將500 μL水楊酸甲酯(50 mg/L)作為內(nèi)標加入1 mL正己烷萃取液，隨后通過30 m×0.25 mm的Agilent DB-WAX毛細管柱(Agilent Scientific，Santa Clara，USA) 并使用Agilent 7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)系統(tǒng)(Agilent Technologies，Santa Clara，USA)測定FA含量。

儀器分析條件：分流比10 ∶1，進樣口溫度 280 ℃，傳輸線溫度250 ℃，進樣體積為1 μL；以高純氮氣為載氣，氮氣流速1.0 mL/min，恒流模式，壓力190 kPa。升溫程序：在50 ℃下保持3 min，以 10 ℃/min 的速率升溫至220 ℃，保持15 min，再以5 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持20 min。質(zhì)譜采用全掃描法測定，范圍為35～780m/z。將34種脂肪酸標準品和甲酯化后的樣品進行儀器分析，以脂肪酸甲酯標準溶液中各脂肪酸甲酯混合液(1 000 μg/mL)進行歸一化法定量[15]。

1.3.3 脂肪酸去飽和酶相關(guān)基因表達水平測定 稱取建蘭根系樣品50 mg采用冷凍研缽和研杵進行快速研磨，采用EASY spin Plus Plant RNA Kit試劑盒(RN38 Aidlab，北京)提取研磨樣的總RNA，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，并采用H6132型分光光度計(H6132，Eppendorf，Hamburg，Germany)對RNA進行純度測定。采用TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit With gDNA Eraser (PC5402，Aidlab)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為第1鏈cDNA。根據(jù)目前GenBank序列數(shù)據(jù)庫的蘭花(Cymbidium)FA基因(CyFAD2、CyFAD6、CyFAC9、CyFAZ15)，采用Primer Express 5.0軟件設(shè)計擴增引物(表1)，內(nèi)參基因(TUB)參考曹映輝等的研究[16]。

表1 脂肪酸去飽和酶相關(guān)基因的qRT-PCR引物序列信息

定量實時聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)包含2×10 μL AceQ qPCR SYBR Green Master Mix、0.4 μL 正反向引物、2 μL cDNA模板和7.2 μL ddH2O。使用CFX97 實時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA) 進行qRT-PCR擴增，程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃熔化變性 10 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸15 s。實時定量結(jié)果采用2-ΔΔCT算法進行相對表達量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2013進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 23.0軟件進行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(α=0.05)，采用Origin 2018進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下菌根真菌與建蘭共生體系的建立

由圖1可見，未接種菌根真菌的CK處理沒有觀察到共生結(jié)構(gòu)(圖1-a)，而在接種處理中皆發(fā)現(xiàn)共生結(jié)構(gòu)(圖1-b、圖1-c)。在對土壤進行的重分離中，以水分正常供應(yīng)條件處理(WW)顯著大于干旱條件處理(DS)，表明干旱會降低菌根真菌在土壤中存活。就試驗數(shù)據(jù)來看，無論在WW還是DS條件下，各菌根真菌處理(CE、TU、SE)均以TU處理較高；其中在WW中，各處理均差異不顯著，而DS條件下，兩兩處理間均差異顯著，以TU處理分離率最高，較CE、SE分別顯著提高11.33、4.66百分點。

2.2 干旱脅迫下菌根真菌對建蘭氧化系統(tǒng)的影響

2.3 干旱脅迫下菌根真菌對建蘭脂肪酸組成的影響

2.3.1 干旱脅迫下菌根真菌對建蘭飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸組分的影響 基于34種脂肪酸(FAs)標準樣品的GC-MS定量分析，在建蘭根系中鑒定出11種飽和脂肪酸(SFA)和10種不飽和脂肪酸(UFA)(表2)。根系中的主要FAs為棕櫚酸(C16：0)和硬脂酸(C18：0)，二者分別占總FAs的38.91%～47.96%和26.05%～30.15%。根系中的主要UFA為油酸(C18：1)、亞油酸(C18：2)和α-亞油酸(C18：3n3)，分別占總FAs的2.99%～5.49%、9.86%～13.84%和3.59%～5.64%。與WW條件相比，DS處理導(dǎo)致肉豆蔻烯酸(C14：1)、棕櫚油酸(C16：1)、十七烯酸(C17：1)、油酸(C18：1)、亞油酸(C18：2)和α-亞油酸(C18：3n3)的含量整體顯著降低，而接種菌根真菌與否僅影響數(shù)值大小但不能改變這種趨勢。在SFA組分中，無論WW還是DS條件下，與CK處理相比， 菌根真菌接種處理均顯著降低了硬脂酸(C18：0)、花生酸(C20：0)、木醋酸(C24：0)含量。在UFA組分中，無論WW還是DS條件下，與CK處理相比，菌根真菌接種處理均顯著增加了肉豆蔻烯酸(C14：1)、十七烯酸(C17：1)、亞油酸(C18：2)、順-11，14，17-二十碳三烯酸(C20：3n3)、花生四烯酸(C20：4n6)、順-13，16-二十二碳二烯酸(C22：2)的含量。

2.3.2 干旱脅迫下菌根真菌對建蘭UFA、SFA比例的影響 由圖3可知，處于干旱條件(DS)下各處理根系UFA/SFA比例皆顯著低于正常水分處理(WW)。就WW條件而言，各處理呈CK

2.3.3 干旱脅迫下菌根真菌對建蘭脂肪酸去飽和酶相關(guān)基因表達的影響 由圖4可知，處于干旱條件(DS)下各處理根系CyFAD2、CyFAD6、CyFAC9的相對表達量皆整體高于正常水分處理(WW)，而在CyFAZ15中則呈相反趨勢。就CyFAD2而言，WW條件下CK顯著低于接種菌根真菌處理；DS條件下亦以CK處理最低，其中與CE處理無顯著差異，二者均顯著小于TU、SE處理；整體來看，以DS-TU顯著大于其他處理，余下處理較其顯著降低29.24%～87.47%(圖4-a)。在CyFAD6中，無論WW還是DS條件下，皆以CK處理顯著小于菌根真菌處理，且對應(yīng)處理中均以DS顯著大于WW(圖4-b)。在CyFAC9中，WW條件下，以菌根真菌處理小于CK處理，但兩兩處理間均無顯著差異；在DS條件下，與CK處理相比，菌根真菌處理提高，其中TU處理顯著大于CK (圖4-c)。在CyFAZ15中，WW條件下較CK處理相比，菌根真菌處理顯著提高476.47%～539.71%；DS條件下，菌根真菌處理亦高于CK處理，但處理間均無顯著差異(圖4-d)。

2.4 干旱脅迫下菌根真菌對建蘭水分利用的影響

由圖5可知，在水分利用效率(WUE)和相對含水量(RWC)指標中，整體以WW大于DS。無論WW還是DS條件下，與其相應(yīng)水分條件的CK處理相比，膠膜菌(Tulasnellasp.)、角擔(dān)菌(Ceratobasidiumsp.)和蠟殼菌(Sebacinasp.)皆整體提高了上述水分利用參數(shù)，且膠膜菌處理(TU)下各水分利用參數(shù)皆具有較優(yōu)值。在WW條件下，WUE、RWC均呈CK

3 討論

蘭科菌根作為陸生植物主要的菌根類型之一，其共生關(guān)系貫穿了蘭科植物從種子萌發(fā)到開花的整個生長史[11]。角擔(dān)菌(Ceratobasidiumsp.)、膠膜菌(Tulasnellasp.)和蠟殼菌(Sebacinasp.)是土壤中3種重要的功能性蘭科菌根真菌，三者在形態(tài)學(xué)、基因結(jié)構(gòu)上較為相似[17]，然而關(guān)于三者的功能強弱知之甚少。本研究中，從建蘭根系分離出的角擔(dān)菌(Ceratobasidiumsp.)、膠膜菌(Tulasnellasp.)和蠟殼菌(Sebacinasp.)均可與小桃紅建立共生關(guān)系，正常水分條件(WW)下，該3株真菌的土壤分離率為89.33%～91.33%；而干旱脅迫條件(DS)下分離率均顯著下降，表明干旱脅迫對菌根共生存在不利影響，其中無論是否干旱脅迫下膠膜菌接種處理(TU)皆最高，其中干旱脅迫下TU處理顯著高于角擔(dān)菌(CE)和蠟殼菌(SE)。

脂肪酸(FAs)是細胞膜的主要組成部分，F(xiàn)As分為飽和脂肪酸(SFA)和不飽和脂肪酸(UFA)，SFA與UFA間的轉(zhuǎn)化對細胞的生理功能起著重要作用[18]，較高的UFA含量被視為植物耐旱性的重要體現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酸(C16：0)、硬脂酸(C18：0)、油酸(C18：1)、亞油酸(C18：2)和α-亞油酸(C18：3n3)是建蘭根系FAs的主要成分；與CK處理相比，接種菌根真菌處理在WW和DS條件下均表現(xiàn)出更高的UFA/SFA值，接種菌根真菌處理提高植株脂肪酸不飽和度歸因于SFA減少(主要為C18：0、C20：0、C24：0)和UFA增加(主要為C14：1、C17：1、C18：2和C20：3n3、C20：4n6、C22：2)，這意味著接種菌根真菌可保持細胞膜的流動性，從而提高植株水分利用效率[19]。

組織中FAs的組成和不飽和度顯著影響細胞膜脂質(zhì)流動性，其飽和度主要由FAs去飽和酶基因表達調(diào)控[20]。本研究中，與CK處理相比，DS條件下菌根真菌處理的CyFAC9表達量發(fā)生顯著上調(diào)，而在WW下沒有明顯差異。在高等植物中FAC9可調(diào)控棕櫚酸、硬脂酸雙鍵的合成，從而轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸(C16：1)、油酸(C18：1)[18]。因此DS條件下CyFAC9表達上調(diào)導(dǎo)致菌根真菌接種處理中C18：1含量增加。前人研究表明，F(xiàn)AZ15的表達可使C18：2去飽和轉(zhuǎn)化為α-亞油酸(C18：3n3)[21]。WW條件下，與CK處理相比，接種菌根真菌處理根系中C18：3n3含量的顯著升高歸因于CyFAZ15的超高表達。此外，本研究表明建蘭根系中CyFAD2、CyFAD6的表達模式與亞油酸(C18：2)含量的變化趨勢基本一致；然而，本研究中，并非所有基因都與其相應(yīng)FAs含量呈完全一致的趨勢，例如CyFAC9的表達模式與C16：1(在WW和DS下)和C18：1含量變化之間存在差異性。這可能是由于：(1)單個脂肪酸的去飽和酶由多個基因控制，而不是由單個基因控制[18，22]；(2)植物根部的FAs含量存在動態(tài)變化，F(xiàn)As去飽和酶基因的上調(diào)表達并不一定意味著其相應(yīng)的FAs積累更多[8，20]。

水分利用參數(shù)可反映環(huán)境水分不足時植物組織在蒸騰作用過程中的耗水程度和恢復(fù)能力的差異[26]。本研究表明，與WW相比，DS環(huán)境下的水分利用效率(WUE)及相對含水量(RWC)均較低，且無論WW還是DS條件下，CE、SE處理皆提高了WUE和RWC，但整體以SE處理優(yōu)于CE處理。前人研究表明蘭科菌根真菌自由基菌絲是親水性蛋白菌絲，可有效吸附水分，或通過保護自由基菌絲免受外部環(huán)境干燥的影響[27]，這可能是蘭科菌根真菌處理提高水分利用的原因。此外，本研究表明無論WW還是DS條件下，TU處理均具有較大值，且較WW-CK處理相比，WUE、RWC指標中DS-TU處理分別顯著提高26.92%、4.41%。

4 結(jié)論

本研究表明，接種角擔(dān)菌(Ceratobasidiumsp.)、膠膜菌(Tulasnellasp.)和蠟殼菌(Sebacinasp.)提高了建蘭通過調(diào)控脂肪酸去飽和酶基因(CyFAD2、CyFAD6、CyFAC9、CyFAZ15)的表達，顯著增加了正常水分(WW)和干旱條件(DS)條件下建蘭根系肉豆蔻烯酸(C14：1)、十七烯酸(C17：1)、亞油酸(C18：2)、順-11，14，17-二十碳三烯酸(C20：3n3)、花生四烯酸(C20：4n6)、順-13，16-二十二碳二烯酸(C22：2)含量以及降低了硬脂酸(C18：0)、花生酸(C20：0)、木醋酸(C24：0)的合成；菌根化建蘭根系脂肪酸的組成變化導(dǎo)致根系脂肪酸的不飽和指數(shù)更高，此外，菌根真菌顯著降低了丙二醛和超氧陰離子自由基含量，這有助于降低氧化損傷。從水分利用試驗數(shù)據(jù)結(jié)果來看，干旱脅迫下以接種膠膜菌(Tulasnellasp.)效果較佳。