劉 靜， 董 陽， 農(nóng)慧蘭， 余 欣， 黃麗媛， 鄭 煥， 陶建敏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095)

葡萄是葡萄科葡萄屬落葉果樹作物，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，其栽培歷史有6 000～7 000年[1]。在我國，葡萄是深受人們喜愛的水果之一，是一種較為暢銷的水果種類，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。葡萄在我國果樹生產(chǎn)中占有至關(guān)重要的地位，是加工深度最高和加工產(chǎn)品最豐富的水果之一[2]，其不僅可用于鮮食，還可用于制干、制汁、制醋、釀酒等。近些年來，中國葡萄的種植，無論是栽培面積，還是產(chǎn)量以及品質(zhì)方面，發(fā)展都非常迅猛，中國已成為世界葡萄生產(chǎn)大國[3]。

葡萄果實(shí)形狀是葡萄重要的外觀品質(zhì)，被認(rèn)為是育種的主要選擇標(biāo)準(zhǔn)之一。根據(jù)葡萄果形特性，可將葡萄果粒形狀分為不同的類型，如指形、圓形、卵形、束腰形、彎形等[4-5]。由于消費(fèi)者喜好不同，果實(shí)形狀在很大程度上影響人們對于葡萄品種的選擇。人們會依據(jù)果實(shí)的大小和形狀來評判其產(chǎn)量、質(zhì)量以及營養(yǎng)價值等重要的經(jīng)濟(jì)性狀。果實(shí)形狀通常用果形指數(shù)(果實(shí)縱徑與果實(shí)橫徑的比值)進(jìn)行表示[6]。隨著社會的發(fā)展，人們的消費(fèi)習(xí)慣也發(fā)生了改變，人們越來越不滿足于當(dāng)前常規(guī)的水果果形，在滿足果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的同時，人們逐漸開始追求一些新奇、獨(dú)特的髙品質(zhì)水果產(chǎn)品。葡萄的果實(shí)形狀在一定程度上影響了葡萄的經(jīng)濟(jì)價值及人們的消費(fèi)選擇[7]。因此，對葡萄果形的研究越來越有必要。

植物激素對果實(shí)的生長發(fā)育具有重要作用。從花到果的轉(zhuǎn)變過程中，植物激素如生長素(IAA)、赤霉素(GA3)、細(xì)胞分裂素等起到了關(guān)鍵作用[8-9]。赤霉素是植物五大激素之一，參與植物許多生長發(fā)育過程，例如開花和坐果[10-11]，生長素和赤霉素都是果實(shí)發(fā)育所需的主要激素[12]。GA3由于具有提高坐果、增大果實(shí)和提高品質(zhì)等方面的作用而被廣泛應(yīng)用于果樹生產(chǎn)實(shí)踐中。研究表明，GA3對果實(shí)生長發(fā)育的影響主要是通過促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和伸長而實(shí)現(xiàn)的[13]。此外，GA3處理后能增加生長素的含量，GA3對生長素的調(diào)節(jié)機(jī)制可能是GA3通過促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解，提高色氨酸的含量，進(jìn)而促進(jìn)生長素的合成；并且GA3也可能通過調(diào)節(jié)結(jié)合態(tài)生長素轉(zhuǎn)化為游離態(tài)生長素、抑制生長素氧化酶來影響生長素水平[14]。一方面，GA3有調(diào)運(yùn)、吸引營養(yǎng)物質(zhì)的作用，對果實(shí)形狀建成也具有一定的影響[15]，另一方面，GA3還可以對生長素的含量進(jìn)行調(diào)節(jié)，說明GA3對果實(shí)的生長發(fā)育具有顯著的影響[16-17]。

目前已經(jīng)有研究表明GA3對于葡萄果形具有顯著的調(diào)節(jié)作用，Dokoozlian等發(fā)現(xiàn)GA3的施用可以增加葡萄果實(shí)長度[18]；Casanova等在研究中進(jìn)一步闡述了GA3對葡萄果實(shí)形狀的影響主要是通過改變葡萄果實(shí)細(xì)胞形態(tài)而實(shí)現(xiàn)的，GA3不影響果實(shí)果皮細(xì)胞數(shù)，但增加果皮細(xì)胞直徑[19]；通過施用赤霉素生長抑制劑如2-氯乙基三甲基氯化銨(CCC)，還可以通過抑制赤霉素的合成，從而使果實(shí)變小[20]；此外，在其他物種上也有許多GA3對果形具有顯著調(diào)節(jié)作用的實(shí)例，在Chen等的研究中分別對番茄施用GA3和赤霉素抑制劑PAC，結(jié)果表明，GA3處理的番茄果實(shí)果形指數(shù)為1.25，顯著高于對照(1.09)，施用PAC使果形指數(shù)降至0.87，說明GA3可以顯著提高番茄果形指數(shù)[21]；Wang等在草莓中發(fā)現(xiàn)了一種短果形的突變體sf，其研究推測該突變體可能是由于GA3合成途徑的缺乏而導(dǎo)致的[22]。Ahmed等研究發(fā)現(xiàn)，在棗樹上施用GA3，可以增加果長和果徑[23]?？傊?，大量研究結(jié)果表明，GA3在調(diào)控果實(shí)形狀方面具有重要的作用。但現(xiàn)有的研究大多是研究外施GA3對果實(shí)外部特征的影響，深入到分子層面上進(jìn)行探究的研究相對較少，目前對GA3調(diào)控果形變化的內(nèi)部分子機(jī)制研究還相對空白。本研究旨在探究GA3對果形影響的內(nèi)部分子機(jī)制，挖掘其潛在的調(diào)控基因，為葡萄果實(shí)形狀調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及其處理方法

試驗(yàn)于2020年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)湯山葡萄試驗(yàn)基地進(jìn)行，以金手指葡萄為試驗(yàn)材料。采用平棚架避雨栽培，株行距為3.0 m×6.0 m。土肥水管理及病蟲害防治同常規(guī)管理。以花序穗肩的第1個小穗上50%的小花開放為盛花期。于盛花后3 d，選取3株樹勢健壯且相近的金手指葡萄植株，使用25 mg/L GA3溶液對幼果進(jìn)行處理，每個處理選取60穗左右，并做好標(biāo)記，以清水作為對照。分別于處理后 6 h、12 h、24 h、48 h、4 d、7 d、14 d采集處理及對照的幼果。處理后7、14 d的樣品置于FAA固定液中，4 ℃保存，用于后續(xù)石蠟切片的制作；處理后 6 h、12 h、24 h、48 h、4 d、7 d的樣品立即用液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)總RNA的提取，其中，部分處理后48 h、4 d的樣品用于后續(xù)內(nèi)源GA3、生長素和IAA-ASP含量的測定。

1.2 成熟期葡萄表型觀察

以處理組(T)和對照組(CK)在成熟期的果實(shí)為樣品。測量樣品的縱徑和橫徑并計(jì)算果形指數(shù)，處理組及對照組均含有20個樣品。

1.3 果實(shí)細(xì)胞的形態(tài)觀察

以處理組和對照組在7、14 d時采集的果實(shí)為樣品制作成石蠟切片。樣品采集之后立即放在FAA固定液中進(jìn)行固定，并置于4 ℃下進(jìn)行保存。樣品以乙醇/二甲苯系列脫水，石蠟包埋，切成3 μm厚的切片，干燥后用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色。采用正置熒光顯微鏡顯微成像系統(tǒng)觀察細(xì)胞形態(tài)，測量細(xì)胞的縱徑和橫徑并計(jì)算細(xì)胞指數(shù)(細(xì)胞縱徑與細(xì)胞橫徑的比值)，每次測量使用來自3個不同樣品的3個切片[24]。

1.4 內(nèi)源GA3、生長素和IAA-ASP含量的測定

以處理組和對照組在48 h和4 d時采集的果實(shí)為樣品，采用高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(ESI-HPLC-MS/MS)測定樣品內(nèi)源GA3、IAA和IAA-ASP的含量。樣品洗凈后在液氮中研磨成粉末，稱取0.5 g樣品粉末，加入4 mL提取緩沖液(檸檬酸、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚和甲醇)。4 ℃振蕩過夜后，10 000g離心15 min，取出上清液。沉淀反復(fù)浸提2次，合并所得上清液。在4 ℃搖動 1 h，轉(zhuǎn)速為120 r/min，10 000g離心15 min。然后將上清液在氮?dú)庀赂稍铮?00 μL甲醇(0.1%甲烷酸)復(fù)溶，并通過0.22 μm的濾膜。色譜條件：采用poroshell 120 SB-C18反相色譜柱(2.1 mm×150 mm，2.7 μm)，進(jìn)樣量為2 μL。質(zhì)譜條件：噴霧電壓 4 500 V，氣幕、霧化器和輔助氣體壓力分別為15、65、70 psi。霧化溫度為400 ℃，進(jìn)行3次獨(dú)立的生物重復(fù)試驗(yàn)[24]。

1.5 葡萄果實(shí)總RNA的提取

以處理組和對照組在6 h、12 h、24 h、48 h、4 d、7 d時采集的果實(shí)為樣品，進(jìn)行總RNA提取，總RNA的提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，按照說明書進(jìn)行操作。取2 μL RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對RNA樣品的質(zhì)量進(jìn)行檢測。用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)檢測RNA濃度。

1.6 熒光定量PCR

采用Q5熒光定量儀進(jìn)行qRT-PCR分析。使用snapgene軟件設(shè)計(jì)引物，引物見表1。所有引物均使用PCR擴(kuò)增、電泳以及溶解曲線進(jìn)行測試，以保證引物特異性。以VvUbiquitin作為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系按SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)試劑盒說明書進(jìn)行操作，進(jìn)行3個生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)，使用2-ΔΔCT公式計(jì)算相對表達(dá)量[25]。

表1 熒光引物設(shè)計(jì)序列

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2010和SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Adobe Photoshop CC 2019作圖，SPSS進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA3處理葡萄成熟期果實(shí)形態(tài)觀察

如圖1所示，金手指葡萄果實(shí)成熟后，使用GA3處理的金手指葡萄外觀出現(xiàn)了明顯的變化：GA3處理的葡萄果形伸長，串型較對照組更為松散，且處理組葡萄果穗變長(圖1-A)；果粒形狀較對照組明顯拉長(圖1-B)，處理組果粒的縱徑為 40.31 mm，顯著大于對照組(28.2 mm)(圖1-C)，但果粒的橫徑無顯著差異(圖1-D)。計(jì)算果形指數(shù)可知，處理組果形指數(shù)為2.58，顯著高于對照組(1.81)(圖1-E)。結(jié)果表明，適當(dāng)GA3處理可以顯著拉長葡萄果實(shí)，增加葡萄果形指數(shù)。此外，GA3處理對葡萄果穗也具有一定的拉長作用。

2.2 GA3處理葡萄果實(shí)組織學(xué)觀察

為進(jìn)一步觀察GA3處理對細(xì)胞發(fā)育的影響，以處理后7、14 d的金手指葡萄果實(shí)為樣品制備石蠟切片。觀察發(fā)現(xiàn)，GA3處理的葡萄果實(shí)細(xì)胞明顯大于對照組，且處理組細(xì)胞較對照組明顯拉長(圖2-A、2-B)；相同的視野內(nèi)處理組所能看到的細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組，說明處理后葡萄果實(shí)內(nèi)部細(xì)胞面積增大(圖2-A、圖2-B)。細(xì)胞縱橫徑測量結(jié)果顯示，處理后7 d，處理組細(xì)胞平均縱徑為 49.02 μm，對照組為 32.87 μm；處理后14 d，處理組細(xì)胞平均縱徑 121.88 μm，對照組為56.98 μm、處理后7、14 d的金手指葡萄果實(shí)細(xì)胞縱徑均顯著變大，其中處理后14 d細(xì)胞縱徑變化更大，但細(xì)胞橫徑變化均不顯著。經(jīng)計(jì)算細(xì)胞指數(shù)可知，處理后7 d，處理組細(xì)胞指數(shù)為2.38，對照組為1.67；處理后14 d，處理組細(xì)胞指數(shù)為2.70，對照組為1.48，細(xì)胞指數(shù)均顯著增大。這些結(jié)果表明，GA3在果實(shí)發(fā)育早期通過促進(jìn)細(xì)胞膨脹和細(xì)胞伸長來增大果實(shí)，從而起到拉長葡萄果實(shí)的效果。

2.3 GA3處理對金手指葡萄果實(shí)中內(nèi)源赤霉素、生長素和IAA-ASP含量水平的影響

通過ESI-HPLC-MS/MS方法測定GA3處理組和清水對照組樣品中內(nèi)源赤霉素(GA3)、生長素(IAA)以及IAA-天冬氨酸(IAA-ASP)的含量。結(jié)果表明，GA3處理48 h、4 d后，處理組葡萄果實(shí)中內(nèi)源赤霉素含量分別為對照組的4.2、4.3倍(圖 3-A)；GA3處理48 h后，葡萄果實(shí)中IAA和IAA-ASP含量開始較對照組升高，且處理后4 d處理組IAA和IAA-ASP含量與對照組之間的差異顯著增大，處理組分別為對照組的2.7、18.4倍(圖3-B、圖3-C)。說明外源GA3處理會使金手指葡萄果實(shí)中的內(nèi)源赤霉素、IAA和IAA-ASP含量升高。

2.4 GA3處理對金手指葡萄果實(shí)中生長素生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)模式變化的影響

為了進(jìn)一步探究生長素對果實(shí)形狀的影響，本研究測定了葡萄果實(shí)中生長素生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)。YUCCA是生長素合成過程中的關(guān)鍵基因，挑選3個YUCCA基因家族的成員VvYUCCA2、VvYUCCA6-1及VvYUCCA6-2進(jìn)行qRT-PCR檢驗(yàn)。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，金手指葡萄中生長素合成相關(guān)基因VvYUCCA表達(dá)量呈升高趨勢，在處理后24 h時達(dá)到最高且與對照組含量差異最大。3個基因表達(dá)趨勢較為一致。GA3處理后24 h時，金手指葡萄中VvYUCCA2、VvYUCCA6-1表達(dá)量為對照組的4～5倍，并隨著時間的推移，處理組與對照組之間的差異逐漸減小，表明GA3處理可能會提高金手指葡萄中VvYUCCA2、VvYUCCA6-1及VvYUCCA6-2基因的表達(dá)水平，從而提高生長素的含量(圖4-A、圖4-B、圖4-C)。IAA1是生長素/吲哚-3-乙酸基因家族成員，是一種生長素信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，與對照組相比，VvIAA1在處理6 h后表達(dá)量無明顯差異，在處理12 h～7d后，表達(dá)水平顯著升高。說明GA3處理會影響金手指葡萄中的生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖 4-D)。AUX22A和AUX22D是2個生長素響應(yīng)基因，GA3處理后VvAUX22A表達(dá)量較對照組呈升高的趨勢，然而VvAUX22D表達(dá)量卻表現(xiàn)出先下降后升高的趨勢，但整體上GA3處理會顯著上調(diào)VvAUX22A和VvAUX22D基因的表達(dá)。VvAUX22A和VvAUX22D處理組表達(dá)量與對照組差異最大的時期都為處理后24 h，此趨勢與3個VvYUCCA基因的表達(dá)一致(圖4-E、圖4-F)。

3 討論

葡萄果形是葡萄重要的外觀品質(zhì)，生產(chǎn)上常用各種植物生長調(diào)節(jié)劑對葡萄果實(shí)形狀進(jìn)行調(diào)節(jié)。GA3常在生產(chǎn)上被用于果實(shí)品質(zhì)的調(diào)節(jié)，是一種應(yīng)用較為廣泛的植物生長調(diào)節(jié)劑。但其具體作用機(jī)制現(xiàn)在還不明晰，本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，選擇長形葡萄品種金手指為試驗(yàn)材料，探究GA3對葡萄果形的影響。結(jié)果表明，在盛花期后3 d施用GA3可以顯著拉長金手指葡萄果粒，這與謝周等的研究結(jié)果[26]一致。同時，葡萄果穗也有一定程度的拉長，葡萄整體串形更為松散，果粒生長空間大，更適于葡萄生長，這與李蕊蕊等的研究結(jié)果[27]一致。依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測，GA3的拉長作用可能不僅限于果實(shí)，它對其他植物器官可能也具有拉長作用，并可能通過改變植物組織的內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用。

GA3已被證實(shí)具有促進(jìn)細(xì)胞伸長的作用[28]，但其對葡萄果實(shí)的拉長作用是否是通過促進(jìn)果實(shí)內(nèi)部細(xì)胞伸長而實(shí)現(xiàn)尚不清楚。因此，本研究選擇GA3處理后7、14 d的果實(shí)為樣品制作石蠟切片，觀察果實(shí)內(nèi)部細(xì)胞形態(tài)，測量細(xì)胞縱徑、橫徑并計(jì)算細(xì)胞指數(shù)。結(jié)果表明，處理組果實(shí)內(nèi)部細(xì)胞確實(shí)較對照組大且長；細(xì)胞縱橫徑及細(xì)胞指數(shù)規(guī)律進(jìn)一步驗(yàn)證了“果實(shí)細(xì)胞顯著伸長”這一結(jié)論，據(jù)此可初步驗(yàn)證GA3對金手指葡萄果形的影響是通過改變細(xì)胞形狀而實(shí)現(xiàn)的。植物激素共同作用于植物器官生長[29]，赤霉素可能會通過與其他激素共同作用來促進(jìn)葡萄果實(shí)伸長，生長素是與果實(shí)發(fā)育息息相關(guān)的植物激素[30]，IAA-ASP是生長素的主要儲存形式[31]。本研究利用ESI-HPLC-MS/MS方法測定了金手指葡萄果實(shí)中的內(nèi)源赤霉素、生長素和 IAA-ASP 含量。結(jié)果表明，GA3處理可以提高果實(shí)內(nèi)源赤霉素、生長素及IAA-ASP含量，這與前人的研究結(jié)果[32-33]相近，推測GA3作用于金手指葡萄果實(shí)后可能會引起果實(shí)內(nèi)源激素的變化，從而調(diào)節(jié)果形變化。此外，GA3處理48 h后IAA和IAA-ASP含量差異較小，但處理后4 d的IAA和IAA-ASP含量較對照組差異極顯著，據(jù)此推測GA3對IAA和IAA-ASP含量的促進(jìn)作用可能是在處理后48 h這段時間內(nèi)逐漸發(fā)生的。

YUCCA作為生長素合成過程中的關(guān)鍵基因，YUCCA基因的激活或者過表達(dá)都會導(dǎo)致游離的生長素含量升高，且YUCCA基因家族多功能冗余，可能需多個基因協(xié)同發(fā)揮作用[34]。本研究中選擇3個YUCCA基因家族的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明3個基因家族表達(dá)趨勢基本一致，說明這3個基因可共同作用于生長素的合成。推測GA3處理可以通過提高YUCCA基因表達(dá)水平來提高游離態(tài)IAA的含量，從而促進(jìn)果實(shí)伸長。處理組與對照組中YUCCA基因的含量及含量差異均在24 h處達(dá)到最高值，推測GA3對果實(shí)伸長的促進(jìn)作用可能主要發(fā)生在處理后12～48 h之間。根據(jù)IAA1的表達(dá)趨勢也可以推測GA3處理可能通過影響上游生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)的含量來調(diào)控果形變化。通過 qRT-PCR 技術(shù)對2個生長素響應(yīng)基因AUX22A和AUX22D的驗(yàn)證推測GA3處理也可能通過影響下游生長素響應(yīng)基因的表達(dá)來調(diào)控果形變化。此外，GA3處理后VvAUX22A表達(dá)量較對照組呈升高的趨勢，但VvAUX22D表達(dá)量卻表現(xiàn)出先下降后升高的趨勢，然而整體趨勢與VvAUX22A相似，推測2種響應(yīng)基因之間可能存在著先后關(guān)系。

4 結(jié)論

在金手指葡萄盛花期后3 d，使用25 mg/L GA3溶液浸泡幼果，可顯著拉長葡萄果實(shí)，同時果實(shí)內(nèi)部細(xì)胞發(fā)生膨大且細(xì)胞指數(shù)變大。外源赤霉素處理可能通過調(diào)節(jié)葡萄果實(shí)中內(nèi)源生長素的合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來影響葡萄果實(shí)形狀。