李 錚， 王金輝， 丁麗麗， 張 岱， 田夢君， 楊志輝， 朱杰華

(1.河北農業(yè)大學植物保護學院/河北省植物病蟲害生物防治工程技術研究中心，河北保定 071000；2.河北省農林科學院生物技術與食品科學研究所，河北石家莊 050057； 3.秦皇島市植保植檢站，河北秦皇島 066000)

近年來我國馬鈴薯種植面積逐年增加，但是連作致使馬鈴薯枯萎病的發(fā)生逐年加重，嚴重影響了馬鈴薯的產量，成為制約我國馬鈴薯產業(yè)發(fā)展的重要因素。該病害由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)所引起，已成為嚴重威脅馬鈴薯產業(yè)的重要土傳病害之一[1]。該病原菌抗逆性強，使用化學殺菌劑防治效果較差，長期使用還會造成環(huán)境污染和農藥殘留[2]。而生物防治可作為綠色防治手段，能有效解決化學殺菌劑所帶來的環(huán)境污染問題。

生物防治具有綠色無污染的特點，在多種病害防治過程中得到廣泛應用。芽孢桿菌抗逆性強，廣泛存在于土壤、植物表面及內部，對人和動物無毒害的同時還具有廣譜抑菌活性[3]。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是芽孢桿菌的一種，具有抑菌譜廣、抗逆性強、生防機制多樣等特點[4]，已成功應用于多種植物病害的防治過程，且效果顯著。如貝萊斯芽孢桿菌E69對稻瘟病的田間防效可達85.97%[5]；貝萊斯芽孢桿菌B-36在盆栽試驗中，對由尖孢鐮刀菌引起的蓮根腐病的防效最高可達77.1%[6]。貝萊斯芽孢桿菌能夠合成分泌多種次級代謝產物實現(xiàn)對病原菌的抑制作用[7-8]，主要包括由核糖體合成的細菌素和水解酶類，由非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)合成的脂肽類化合物及多肽類化合物，以及由聚酮合成酶(polyketidesynthase，PKS)合成的聚酮類化合物[4，9]。細菌素、脂肽類物質理化性質穩(wěn)定、抗菌譜廣、不易產生耐藥性，是生物防治研究的重點[10]。此外，貝萊斯芽孢桿菌分泌的蛋白酶、幾丁質酶和β-葡聚糖酶等對抑制病原真菌起重要作用[11]。

本實驗室前期從馬鈴薯植株根際土壤中分離得到菌株NZ-4，該菌株對馬鈴薯枯萎病菌具有良好的抑制作用，抑菌圈直徑在20.0 mm以上。基于gyrB基因的系統(tǒng)發(fā)育分析以及形態(tài)學特征，將菌株NZ-4初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌[12]，但基于單一基因位點的分析方法難以有效區(qū)分包括貝萊斯芽孢桿菌在內的枯草芽孢桿菌復合群[13]。隨著測序技術的發(fā)展，通過基因組數據分析物種間的親緣關系更加行之有效[4]。前期研究表明，菌株NZ-4的抑菌譜較廣，對包括馬鈴薯枯萎病菌、馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、馬鈴薯瘡痂病菌(Streptomycesscabies)等有強烈的抑菌作用，且對小麥根腐病菌(Cochliobolussativus)、梨黑斑病菌(AlternariakikuchianaTanaka)、蘋果斑點落葉病菌(Alternariaalternariaf. sp. mali)、馬鈴薯早疫病菌(Alternariasolani)等重要農業(yè)病害病原菌也有良好的拮抗活性[12]。此外，本研究室研究表明，該菌株具有促生、增強植株抗性水平、根際定殖能力強等多種應用潛力[14]。而該菌無菌發(fā)酵液(含有抑菌作用的次生代謝產物)對外界環(huán)境條件穩(wěn)定性、抑菌促生相關酶類活性有無及抑菌物質的遺傳基礎仍不明確。

本研究測定了高溫、強酸堿、紫外線和蛋白酶處理下貝萊斯芽孢桿菌NZ-4發(fā)酵濾液對引起馬鈴薯枯萎病的尖孢鐮刀菌的抑菌活性穩(wěn)定性，通過平板試驗測定了其產生抑菌活性物質的能力，結合第二代(Illumina NovaSeq)和第三代(PacBio)測序技術，獲得NZ-4完整的基因組序列，并挖掘了其脂肽類、聚酮類化合物、幾丁質酶等主要抑菌活性物質的遺傳基礎，為生防菌劑開發(fā)和機理研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)菌株NZ-4和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，均由河北農業(yè)大學植物保護學院馬鈴薯病害研究實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、蛋白酶鑒定培養(yǎng)基[15]、酪蛋白酶鑒定培養(yǎng)基[16]、幾丁質酶鑒定培養(yǎng)基[17]、纖維素酶鑒定培養(yǎng)基[18]、果膠酶鑒定培養(yǎng)基[19]、CAS培養(yǎng)基[20]。

1.1.3 菌株NZ-4發(fā)酵濾液的制備 挑取菌株NZ-4單菌落接種于LB培養(yǎng)基，180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h獲得種子液。將種子液接種于LB培養(yǎng)基中，180 r/min、36 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，獲得發(fā)酵液。將發(fā)酵液10 000 r/min離心20 min，上清液通過0.22 μm的微孔過濾器后得到發(fā)酵濾液。

1.2 菌株NZ-4發(fā)酵濾液的抑菌活性穩(wěn)定性檢測

1.2.1 菌株NZ-4發(fā)酵濾液處理 (1)酸堿穩(wěn)定性：將發(fā)酵液的pH值分別調為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，于4 ℃靜置12 h后調節(jié)pH值=7.0。(2)紫外光穩(wěn)定性：將菌株 NZ-4 發(fā)酵濾液置于距離紫外燈30 cm處，照射1、2、4、8、12、16、20 h。(3)熱穩(wěn)定性：將發(fā)酵液分別在40、50、60、70、80、90、100 ℃水浴30 min或121 ℃處理20 min后，冷卻至室溫(25 ℃)。(4)蛋白酶穩(wěn)定性：在發(fā)酵液中分別加入蛋白酶K或胰蛋白酶，使酶終濃度為1 mg/mL，37 ℃反應2 h。

1.2.2 抑菌活性的檢測 PDA平板中加入1.5 mL發(fā)酵濾液，用涂布器充分涂抹均勻后在超凈工作臺中晾干備用。以尖孢鐮刀菌為供試菌、以未經處理的發(fā)酵濾液為陽性對照、以清水為陰性對照，25 ℃倒置培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，進行2組試驗，每組試驗設置4次重復。

1.2.3 數據處理分析 根據下列公式計算菌株 NZ-4 發(fā)酵液對尖孢鐮刀菌的相對抑制率：

抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%；

相對抑菌活性=處理抑制率/陽性對照抑制率×100%。

1.3 菌株NZ-4水解酶的檢測

將活化的菌株NZ-4點接到對應的酶鑒定或CAS培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，觀察是否產生透明圈或產生凹陷。

1.4 菌株NZ-4的全基因組測序和分析

1.4.1 菌株NZ-4全基因組測序 收集對數生長期的菌株NZ-4菌體，提取基因組DNA。利用Illumina NovaSeq和PacBio Sequel平臺分別測序，對測序數據進行質控分析，利用HGAP[21]、CANU[22]拼裝三代數據得到contig序列。將二代的數據用pilon[23]軟件對contig進行校正后獲得完整序列。測序和拼裝委托上海派森諾生物科技股份有限公司進行。

1.4.2 基因組系統(tǒng)發(fā)育分析 使用orthofinder[24]獲得與菌株NZ-4近緣的12個芽孢桿菌的單拷貝同源蛋白序列文件，使用muscle[25]進行多序列比對。后使用MegaX[26]默認參數構建NJ(neighbour-joining)發(fā)育樹，bootstrap法重復1 000次檢驗進化樹。

1.4.3 編碼蛋白基因的分析 將菌株NZ-4的完整序列上傳至NCBI數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/)Prokaryotic Genome Annotation Pipeline(PGAP)進行功能注釋。利用PSIblast v2.9.0[27]將菌株NZ-4的蛋白序列分別與COG[28]和CAZy[29]數據庫進行比對，獲得功能注釋信息。利用antiSMASH 6.0[30]對NZ-4菌株中次生代謝物合成基因組簇進行預測。

2 結果與分析

2.1 菌株NZ-4無菌發(fā)酵濾液對尖孢鐮刀菌的抑菌穩(wěn)定性

菌株NZ-4發(fā)酵液在50 ℃處理后抑菌活性為80.7%，當超過60 ℃后，隨著溫度的升高抑菌活性逐漸下降(圖1-A)，100 ℃處理后抑菌活性約60.0%，121 ℃處理后幾乎喪失抑菌活性。菌株 NZ-4 發(fā)酵濾液抑菌活性的最適pH值為6～9(圖 1-B)，pH值=3處理后抑菌活性仍在85%以上，當pH值超過10后，抑菌活性顯著降低。菌株 NZ-4 的抑菌活性物質對紫外線不敏感，隨著紫外線照射時間的延長，其抑菌活性有小幅下降(圖1-C)，紫外線照射20 h后，其抑菌活性仍達76.9%。用蛋白酶K處理2 h后，發(fā)酵液抑菌活性顯著降低，說明菌株NZ-4發(fā)酵液中含有抗菌蛋白(圖1-D)。但發(fā)酵液經胰蛋白酶處理后，抑菌活性沒有明顯改變，表明菌株NZ-4的抑菌物質對胰蛋白酶不敏感。

2.2 菌株NZ-4抑菌促生活性物質的測定

參考不同活性酶的選擇性鑒定培養(yǎng)基，對菌株NZ-4產酶活性進行檢測。結果顯示，菌株NZ-4可在幾丁質酶鑒定培養(yǎng)基(圖2-A)、纖維素酶鑒定培養(yǎng)基(圖2-B)、蛋白酶鑒定培養(yǎng)基(圖2-C)、酪蛋白酶鑒定培養(yǎng)基(圖2-D)和CAS培養(yǎng)基(圖 2-E)上生長并產生透明圈，能夠在果膠酶鑒定培養(yǎng)基上生長，并使培養(yǎng)基產生凹陷(圖2-F)。表明菌株NZ-4能夠產生幾丁質酶、纖維素酶、蛋白酶、酪蛋白酶、果膠酶并能合成鐵載體。該菌株可能通過分泌以上酶類物質，加速土壤中的多種碳水化合物的分解，競爭環(huán)境中稀缺的鐵元素，發(fā)揮其拮抗和促生作用。

2.3 菌株NZ-4基因組概況和系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 菌株NZ-4基因組基本概況 菌株NZ-4基因組全長4 085 407 bp，為環(huán)狀染色體，其GenBank登錄號為CP076119。GC含量為46.31%，包含4 014個編碼基因，3 896個蛋白基因序列(coding sequences，CDS)，65個假基因(pesudogene)，27個核糖體RNA(rRNA)，86個轉運RNA(tRNA)和5個非編碼RNA(ncRNA)，基因組圈圖如圖3所示。

菌株NZ-4編碼基因的COG注釋結果(圖3)顯示，共有3 216個基因獲得功能注釋，注釋結果共分為24類。其中參與次生代謝產物生物合成、運輸和分解代謝功能(Q)的基因共有89個，參與氨基酸轉運與代謝(E)的基因312個，參與脂類轉運與代謝(I)的基因157個，參與無機離子轉運與代謝(P)的基因187個，參與碳水化合物轉運與代謝(G)的基因281個，防御機制(V)相關基因112個。

2.3.2 基于基因組核心基因的系統(tǒng)發(fā)育分析及種類鑒定 基于菌株NZ-4和參考菌株的1 398個單拷貝核心同源基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，結果表明，菌株NZ-4與貝萊斯芽孢桿菌CC09、DSYZ、FZB42、CBMB205、CAU B946和SCGB1等菌株聚為一個大的分支；而與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)聚為不同的分支，表明菌株NZ-4在基因組水平上與貝萊斯芽孢桿菌親緣關系最近。因此基于基因組水平，菌株NZ-4被鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。

2.4 菌株NZ-4抗生素合成相關基因簇的預測

芽孢桿菌抗菌活性與其產生的次生代謝產物密切相關，本研究利用antiSMASH 6.0對菌株NZ-4基因組進行分析，結果顯示，菌株NZ-4編碼14種次生代謝產物合成基因簇。其中有9種與MiBiG中已經描述過的次生代謝產物合成基因簇基本一致(圖5)，它們分別與表面活性素(surfactin)、大環(huán)內酰亞胺H(macrolactin H)、桿菌素(bacillaene)、桿菌霉素D(bacillomycin D)、泛革素(fengycin)、地非西丁(difficidin)、兒茶酚型鐵載體(bacillibactin)、解淀粉芽孢桿菌素(amylocyclicin)和溶桿菌素(bacilysin)的合成相關。此外，菌株NZ-4還編碼5種沒有比對到MiBiG數據庫或相似度比較低、可能為該菌株所特有的次生代謝產物。

這些次生代謝產物中有5種具有抗真菌活性，包括3種脂肽類化合物，分別為表面活性素、泛革素和桿菌霉素，1種二肽溶桿菌素和1種兒茶酚型鐵載體。此外，菌株NZ-4還能合成4種對細菌有抑制作用的次生代謝產物，包括3種聚酮類化合物，分別為桿菌素、大環(huán)內酰亞胺H和地非西丁，以及1種環(huán)肽解淀粉芽孢桿菌素。菌株NZ-4編碼多種抗生素合成基因簇，表明該菌株可能通過這些抗菌產物發(fā)揮其抑菌功能。

2.5 菌株NZ-4碳水化合物活性酶(CAZy)及與生防有關酶類的預測

菌株NZ-4編碼105個CAZy酶類基因(圖6-A)，包括43個糖苷水解酶(glycoside hydrolase，GHs)、36個糖基轉移酶(glycosyl transferase，GTs)、16個碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases，CEs)、6個碳水化合物結合模塊(carbohydrate-binding module，CBMs)(其中4個碳水化合物結合模塊又屬于糖苷水解酶)、3個多糖裂解酶(ploysaccharide lyases，PLs)和5個輔助酶類(auxiliary activities，AAs)。其中GHs家族數目最多，占整個基因家族的41.0%，GTs家族次之，約占34.3%(圖6-B)。其中含有信號肽的CAZyme蛋白有24個(22.9%)，說明它們具有蛋白質跨膜分泌功能。分泌的CAZyme中數量最多的是GHs，43個GHs中有16個含有信號肽，而AAs和GTs中各有1個成員含有信號肽。在這些基因家族中，GH5、GH11、GH26、GH43、GH51和GH53等與纖維素降解有關；GH13和GH126與淀粉水解相關；GH18、GH23、CE9和CBM50等與幾丁質降解相關；GH43、CE4、CE6和CE7等與木聚糖降解相關；GH43、PL1、PL9等與果膠降解酶類相關；GH23和GH73等與肽聚糖降解相關；GH3、GH16和GH30等與葡聚糖酶降解相關。說明菌株NZ-4具有降解纖維素、淀粉、幾丁質、果膠、肽聚糖和葡聚糖等物質的潛力。

3 討論與結論

芽孢桿菌作為生防菌如貝萊斯芽孢桿菌FZB42等，已在多種作物土傳病害的防治過程中取得了顯著成效[7，9，31]。菌株NZ-4是本試驗室從馬鈴薯根際土壤中分離得到的一株貝萊斯芽孢桿菌，對多種重要農作物病原菌有良好的抑制作用[12]。本試驗在此基礎上，進一步研究了菌株NZ-4發(fā)酵濾液的抑菌活性穩(wěn)定性，并通過對該菌株的基因組測序和分析，鑒定到該菌株發(fā)揮促生和生防作用的潛在物質，為該菌株的開發(fā)利用和機理研究奠定了基礎。

本研究發(fā)現(xiàn)，菌株NZ-4發(fā)酵液經過不同溫度、pH值、紫外照射和蛋白酶處理后，其抑菌活性在極端條件下會發(fā)生變化，說明該菌株的抑菌物質會受到外界極端環(huán)境的影響，該特性與已報道的其他芽孢桿菌相似[32-34]。 菌株NZ-4的發(fā)酵液在常規(guī)條件下具有良好的穩(wěn)定性，但在極端條件下的穩(wěn)定性變化，可能與發(fā)酵液中抗菌物質的種類或活性變化有關?？傊?，該菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性較強，能適應田間不斷變化的環(huán)境條件，具備在農業(yè)生產中防治枯萎病等土傳病害的潛力。

利用多種碳源快速繁殖和成功定殖是生防菌發(fā)揮生防功能的前提[35]。菌株NZ-4能夠產生并分泌幾丁質酶、纖維素酶、蛋白酶、酪蛋白酶、果膠酶等多種碳水化合物酶，說明該菌株能利用多種碳源生長發(fā)育，這有助于該菌株競爭環(huán)境中營養(yǎng)，為其在各種環(huán)境下的成功定殖奠定基礎。另外，該菌株還能合成分泌鐵載體，此類物質不僅能夠促進植物的生長， 還能與植物病原競爭環(huán)境中微量的鐵元素，從而達到抑菌效果。盆栽和田間試驗結果顯示，菌株NZ-4對馬鈴薯枯萎病有良好的防效，同時經該菌株發(fā)酵液灌根處理的馬鈴薯植株生長狀態(tài)也顯著高于對照組[14]。研究表明，幾丁質酶、纖維素酶和蛋白酶等可以破壞病原真菌細胞壁，從而抑制病原真菌生長[11]。產生水解酶及合成鐵載體，可能是菌株NZ-4發(fā)揮抑菌功能的重要原因。

本研究利用全基因組測序和生物信息學分析得到了該菌株的基因組序列，全長為4 085 407 bp，這與先前研究中所測定的貝萊斯芽孢桿菌基因組大小相似[32-33]。芽孢桿菌的準確鑒定是開展相關研究的基礎，隨著測序成本的下降，利用基因組序列來鑒定芽孢桿菌已在多種芽孢桿菌的鑒定過程中得到應用。如在貝萊斯芽孢桿菌LF01[36]及貝萊斯芽孢桿菌CMRP4490[37]的鑒定過程中，通過全基因組測序結合基于待測菌株和參考菌株單拷貝核心同源基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行菌株的種類鑒定。本研究同樣充分利用測序數據，使用生物信息學手段，將菌株NZ-4鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

芽孢桿菌產生的抗菌活性物質主要包括脂肽、聚酮及抗菌蛋白等[9，38]。在先前的研究中已經證明，抗菌活性物質的產生可顯著影響芽孢桿菌的抗菌能力，而菌株NZ-4基因組中存在大量與抗菌物質合成基因簇，包括與已報道的大環(huán)內酰亞胺H、桿菌素、桿菌霉素、泛革素、地非西丁、兒茶酚型鐵載體、解淀粉芽孢桿菌素和溶桿菌素等物質完全一致的合成基因簇，以及同源性較高的表面活性素等物質，說明菌株NZ-4至少具有合成上述抗生素的潛力。其中表面活性素是一種廣譜性的抗菌物質，能夠改變細胞膜的結構發(fā)揮抗菌和抗病毒活性[39]，能在極端的pH值、溫度和鹽濃度下發(fā)揮作用[40]，而NZ-4基因組中同樣存在表面活性素的合成基因簇，這可能是菌株NZ-4發(fā)酵濾液抑菌穩(wěn)定性較高的原因之一。兒茶酚型鐵載體是一種對鐵離子具有高親和性的螯合劑，可以競爭性結合環(huán)境中病原菌生長必需的鐵離子[41]。桿菌素是一種多聚烯類抗生素，能夠抑制原核生物蛋白質的合成[42]，而上述物質在NZ-4中的作用仍需進一步研究。總的來說，菌株NZ-4的抗菌物質合成基因簇豐富，其對病原真菌的抑菌活性可能主要來源于這些已知的具有良好抑菌活性的物質，而其他尚不明確的代謝物同樣可能具有一定的抑菌活性。

CAZy分析結果顯示，菌株NZ-4基因組中含有大量與蛋白質、纖維素、淀粉、幾丁質、木聚糖、肽聚糖等降解相關的基因，表明菌株NZ-4可以利用多種碳源生長發(fā)育及完成定殖。其中幾丁質酶、葡聚糖酶、纖維素酶和蛋白酶等能夠協(xié)同作用，破壞真菌細胞壁結構，從而抑制一些真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長[11，43]。從平板試驗結果來看，菌株NZ-4能分泌幾丁質酶、纖維素酶和蛋白酶等，說明該菌株能夠產生有活性的酶，進而說明與這些酶的產生相關的基因是具有活性的，該菌株可能以分泌多種水解酶為手段降解病原真菌細胞壁，從而抑制病原菌生長。

本實驗室前期研究表明，菌株NZ-4能抑制包括引起馬鈴薯枯萎病的尖孢鐮刀菌在內的多種植物病原真菌，同時還能夠促進馬鈴薯植株的生長以及誘導馬鈴薯抗病相關酶活性提高，并且該菌株能夠在馬鈴薯根際土壤中成功定殖[14]。說明菌株 NZ-4 具有廣泛的應用范圍，能夠實現(xiàn)“一菌多效”。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株NZ-4發(fā)酵濾液有良好的抑菌穩(wěn)定性，說明該菌株具有適應田間復雜環(huán)境的潛力。本研究對菌株NZ-4進行了全基因測序，從基因組角度分析了該菌株能夠產生的抑菌物質種類，發(fā)現(xiàn)該菌株具有合成和分泌多種抗生素的潛力，這可能是其抑菌譜廣的重要原因，另外該菌株具備的多生物活性令其在植物促生和防病方面有更大的研究價值。綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌NZ-4在植物促生和抗病方面有著巨大的研究潛力和應用價值，本研究則為深入研究和開發(fā)利用該菌株奠定了基礎。