黎霞， 何佳， 王建棟， 申屠文姬， 王紅珍

(浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 311300)

金線蓮為蘭科開唇蘭屬植物花葉開唇蘭、金線蘭的全草，具有保肝護(hù)肝、抗炎、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛、涼血祛風(fēng)、除濕解毒等作用，主治肺結(jié)核咯血、糖尿病、咯血、尿血等癥[1]。金線蓮主要分布于中國福建、浙江、江西等熱帶、亞熱帶地區(qū)，在日本、泰國、越南等國也有稀疏分布[1-2]，其天然蘊藏量稀少，種子在自然條件下發(fā)芽率極低，再加上人類過度采挖和對生態(tài)環(huán)境的破壞，其野生資源瀕危。2016年12月發(fā)布的《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)將其列入附錄Ⅱ的保護(hù)物種，《國家重點保護(hù)野生植物名錄》(第二批)列為二級保護(hù)植物。目前，市場上金線蓮產(chǎn)品主要是人工栽培苗，但因為缺乏金線蓮質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)，市場上金線蓮產(chǎn)品質(zhì)量參次不一，魚目混珠現(xiàn)象時有發(fā)生，嚴(yán)重?fù)p害了消費者利益，使消費者健康受損。

黃酮類物質(zhì)為金線蓮主要活性成分，具有抗炎、抗氧化的效果[3]。本文通過優(yōu)化金線蓮槲皮素、山奈酚提取參數(shù)，建立了金線蓮中槲皮素、山奈酚提取方法并分析該方法的精確性，并對不同栽培時間金線蓮和金線蓮不同組織中槲皮素、山奈酚含量進(jìn)行了分析。本研究將為金線蓮栽培標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

樣品采自福建漳州金線蓮種植基地，經(jīng)浙江農(nóng)林大學(xué)中藥學(xué)科胡潤懷教授、植物學(xué)科教授金水虎鑒定為花葉開唇蘭(A.roxburghii(Wall.) Lindl)。

RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗儀，Waters-2695高效液相色譜儀(美國waters)，waters-2996檢測器(美國waters)，Aglient TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱(美國Aglient)。槲皮素、山奈酚對照品(批號為100081-201408、0861-200001)購自中國食品藥品檢定研究院。色譜級甲醇(德國Merck)，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱Waters C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇∶0.2%磷酸溶液(體積比50∶50)，流速1 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長360 nm。

1.2.2 對照曲線配制

精密稱取槲皮素、山奈酚對照品，溶于甲醇中，配置成濃度為2.75、0.75 mg·mL-1混合母液，依次稀釋2、4、8、16、32倍，每個濃度上樣20 μL，測定目標(biāo)峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。槲皮素、山奈酚回歸方程分別為Y=65 901X-3 133 270，r=0.998 5；Y=769 481X-2 489 683，r=0.999 8。槲皮素、山奈酚在0.04～2.75、0.011～0.750 mg·g-1呈良好線性關(guān)系。

1.3 提取方法的優(yōu)化

1.3.1 最佳溶劑的選擇

準(zhǔn)確稱量0.1 g金線蓮粉末，按料液比1∶10分別加入甲醇∶鹽酸10∶1、乙醇∶鹽酸10∶1、去離子水∶鹽酸10∶1的溶劑中，靜置40 min，60 ℃水浴中超聲90 min后，樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，反相高效液相色譜法(RP-HPLC)檢測槲皮素、山奈酚提取率。

1.3.2 最佳混合溶劑選擇

稱取0.1 g金線蓮粉末，按料液比1∶10分別加入甲醇含量不同的混合溶劑∶鹽酸10∶1的溶劑中，靜置40 min，60 ℃水浴中超聲90 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，RP-HPLC檢測混合溶劑中甲醇含量對槲皮素和山奈酚提取效率?；旌先軇┲屑状己糠謩e為70%、80%、85%、90%、95%、100%。

1.3.3 最佳料液比選擇

在最佳混合溶劑∶鹽酸10∶1中，分別以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50中加入0.1 g金線蓮粉末，靜置40 min，60 ℃水浴中超聲90 min后，樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，RP-HPLC檢測混合溶劑中甲醇含量對槲皮素和山奈酚提取率。

1.3.4 超聲最佳水浴溫度的選擇

在最佳混合溶劑∶鹽酸10∶1，以最佳料液比加入0.1 g金線蓮粉末，靜置40 min，分別在50、60、70、80 ℃水浴中超聲90 min。60 ℃水浴中超聲90 min后，樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，RP-HPLC檢測槲皮素和山奈酚提取率。

1.4 精密度試驗

1.4.1 精密度試驗

取對照品混合液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，測定槲皮素、山奈酚峰面積。測定槲皮素、山奈酚峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，RP-HPLC檢測的精密度。

1.4.2 重復(fù)性試驗

取樣品6份，按1.3節(jié)中優(yōu)化的方法制備樣品溶液，測定槲皮素、山奈酚峰面積，檢測槲皮素、山奈酚RSD，確定試驗重復(fù)性是否良好。

1.4.3 穩(wěn)定性試驗

對照品母液按照1.3中的方法制備。分別在0、12、24、36、48 h進(jìn)樣20 μL，測定槲皮素、山奈酚的RSD，確定目標(biāo)物質(zhì)檢測的穩(wěn)定時間。

1.4.4 回收率試驗

精密稱取0.1 g全草干粉6份，加入對照品母液1 mL，按1.3節(jié)中優(yōu)化的方法制備樣品溶液，進(jìn)樣20 μL，測定槲皮素、山奈酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計算槲皮素、山奈酚的平均回收率。

1.5 不同栽培時間和不同組織中槲皮素和山奈酚含量

分別稱取不同栽培時間及同一栽培時間下金線蓮根、莖、葉和全草0.1 g，在1.3節(jié)中優(yōu)化的方法制備樣品溶液，樣品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，RP-HPLC檢測槲皮素和山奈酚提取效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳條件優(yōu)化

2.1.1 溶劑類型對提取效率的影響

圖1顯示，槲皮素和山奈酚在10∶1的甲醇∶鹽酸溶劑中提取效率均最高。

圖1 溶劑類型對提取效率的影響

2.1.2 混合溶劑中甲醇含量對提取效率的影響

由圖2可知，當(dāng)甲醇含量為90%時，槲皮素和山奈酚的提取效率最高。

圖2 混合溶劑中甲醇含量對提取效率的影響

2.1.3 料液比對提取效率的影響

由圖3可知，當(dāng)料液比為1∶40時，金線蓮中槲皮素、山奈酚的提取效率最高。

圖3 料液比對提取效率的影響

2.1.4 超聲時水浴溫度對提取效率的影響

由圖4可知，70 ℃水浴的提取效果最好。

圖4 水浴溫度對提取效率的影響

2.1.5 超聲時間對提取效率的影響

由圖5可知，超聲處理90 min金線蓮中槲皮素、山奈酚的提取效率最高。

圖5 超聲時間對槲皮素、山奈酚提取效率的影響

綜上所述，提取金線蓮中槲皮素、山奈酚的最佳方法為：按料液比1∶40加入甲醇∶鹽酸10∶1的溶劑，靜置40 min，70 ℃水浴中超聲90 min。

2.2 精密度試驗

2.2.1 精密度試驗

取對照品混合液，連續(xù)進(jìn)樣6次，槲皮素、山奈酚峰面積RSD分別為2.37%、1.03%，表明RP-HPLC檢測體系精密度準(zhǔn)確。

2.2.2 重復(fù)性試驗

取樣品6份，按1.4節(jié)中優(yōu)化的方法制備樣品溶液，槲皮素、山奈粉RSD分別為2.68%和2.07%，表明試驗重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗

對照品母液按照1.3節(jié)中的方法制備。分別在0、12、24、36、48 h進(jìn)樣20 μL測定槲皮素、山奈酚峰面積，其RSD分別為1.53%、1.57%，表明目標(biāo)物質(zhì)在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 回收率試驗

精密稱取0.1 g全草干粉6份，加入對照品母液1 mL，按1.4節(jié)中優(yōu)化的方法制備樣品溶液，進(jìn)樣20 μL，測定槲皮素、山奈酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計算槲皮素、山奈酚的平均回收率分別為95.23%、98.23%。

2.3 不同栽培月齡及不同組織中目標(biāo)物質(zhì)分布

準(zhǔn)確稱量不同月齡金線蓮根、莖、葉和全草的干粉(0.1 g)，按料液比1∶40加入95%甲醇∶鹽酸10∶1的混合溶劑4 mL，靜置40 min，稱重。置于70 ℃水浴中超聲90 min，放至室溫，補至超聲前質(zhì)量，離心并經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，20 μL上樣。測定槲皮素、山奈酚峰面積，計算樣品中槲皮素、山奈酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1顯示，槲皮素在不同栽培月齡金線蓮的葉中含量最高，根、莖中含量極低或者檢測不到，全草含量略低于葉，且3個月栽培月齡金線蓮的葉含量最高，為1.29 mg·g-1，全草中含量為0.54 mg·g-1。不同栽培月齡金線蓮不同組織中，山奈酚的分布無明顯差異(0.44～0.53 mg·g-1)，其中，3個月栽培月齡的葉中含量最高，約為 0.53 mg·g-1。

表1 槲皮素、山奈酚在花葉開唇蘭中的分布

3 小結(jié)與討論

黃酮醇是自然界存在最廣泛的黃酮類物質(zhì)，近年研究表明，黃酮醇具有抗癌、抗氧化和抗炎作用[11-12]，槲皮素、山奈酚是具有代表性的黃酮醇[13]。

金線蓮含有豐富的黃酮類化合物，且槲皮素、山奈酚多以黃酮醇苷元形式存在[8-10,14]。因此，在測定槲皮素、山奈酚含量的過程中，采用有機溶劑和鹽酸(10∶1)的混合溶劑，通過酸水解反應(yīng)，將黃酮醇苷水解成黃酮醇苷元，再測定其含量。在含量測定過程中，有機溶劑類型、濃度以及水浴溫度、超聲時間等都會影響黃酮醇含量的測定，因此，本文對這些條件進(jìn)行優(yōu)化，最后確定槲皮素、山奈酚提取的最佳條件。

黃酮類化合物呈弱酸性，因此首先用乙腈∶甲醇∶0.5%醋酸銨溶液為流動相，槲皮素、山奈酚保留時間分別為8.110、13.951 min，分離度良好。但是，在測試樣品時，槲皮素與雜質(zhì)峰沒有完全分開。本文采用福建金線蓮中黃酮類物質(zhì)的含量所用的流動相甲醇∶0.2%磷酸50∶50[13]，槲皮素、山奈酚出峰時間13.037、22.639 min，色譜峰分離良好，和雜質(zhì)峰也完全分開。

金線蓮大棚栽培階段，槲皮素、山奈酚均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，移栽3個月時，全草中槲皮素、山奈酚含量最高，移栽4個月時開始呈下降趨勢。研究結(jié)果與蔣元斌[15]的結(jié)果一致，槲皮素、山奈酚最高含量出現(xiàn)的時間可能因為移栽月份不同而有差異。槲皮素在金線蓮葉中含量最高，在莖、根中的含量很低，低至用現(xiàn)有的方法檢測不到。山奈酚在葉中的分布略高于莖和根。槲皮素、山奈酚在葉中含量高于莖中，且變化趨勢與全草相同，該結(jié)果與蔣元斌對不同栽培時期福建金線蓮、臺灣金線蓮中槲皮素、山奈酚的動態(tài)變化一致。