孟云，董保龍，董曉驊，彭江山，郭輝軍，張旭升，杜雪芹，楊曉軍，，4，5

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院 普通外科，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅省外科腫瘤分子診斷與精準(zhǔn)治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000；5. 甘肅省消化道惡性腫瘤防控工程研究中心，甘肅 蘭州 730000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第五大最常見的惡性腫瘤，也是全球癌癥病死率的第三大常見原因[1]，5年生存率約為7%[2]。在我國目前已經(jīng)超越胃癌位居我國惡性腫瘤死因的第二位[3]。HCC的發(fā)展是一個從慢性炎癥，肝硬化，原發(fā)性HCC到轉(zhuǎn)移性HCC的多步驟連續(xù)過程[4]，主要致病因素有慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、慢性飲酒和非酒精性脂肪肝[5]。HCC通常在晚期發(fā)現(xiàn)，治療潛力有限，致使高病死率[2,6]。因此，迫切需要開發(fā)更有效的預(yù)后模型，為HCC的早期預(yù)防及臨床診治措施的研發(fā)奠定基礎(chǔ)，以期降低發(fā)病率與病死率。

銅是人體生命活動不可或缺的微量元素[7]。研究[8-10]表明，與健康人相比，癌癥患者血清和腫瘤組織中的銅水平顯著升高。雖然銅穩(wěn)態(tài)的失調(diào)可能觸發(fā)細(xì)胞毒性，但細(xì)胞內(nèi)銅水平的改變可能影響癌癥的發(fā)生發(fā)展[11]。銅離子載體和銅螯合劑已應(yīng)用于抗癌治療[12-14]。最近一項(xiàng)研究[15]發(fā)現(xiàn)了一種不同于凋亡、壞死、焦亡和鐵死亡的銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方式，并將其稱為“銅死亡”。當(dāng)已知的細(xì)胞死亡機(jī)制被阻斷時，銅離子仍能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，在線粒體呼吸過程中，銅離子通過與線粒體三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)中的脂?；煞种苯咏Y(jié)合導(dǎo)致脂酰化蛋白的聚集而發(fā)生銅死亡。此外，銅離子還可以降低Fe-S團(tuán)簇的蛋白質(zhì)水平。它們都能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激反應(yīng)，并最終導(dǎo)致死亡[15]。

銅在肝臟中的代謝和對肝癌發(fā)展的作用目前仍在研究中。張燕軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，銅含量與肝硬化和HCC密切相關(guān)，血清銅和銅藍(lán)蛋白水平可作為檢測HCC的標(biāo)志物。Koizumi等[17]研究表明，氧化還原活性的游離銅水平的升高可能與急性肝炎有關(guān)，并最終發(fā)展為肝癌。此外，Siddiqui等[18]研究表明，氧化銅納米顆粒誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性和凋亡呈劑量依賴性，這很可能分別是由活性氧和線粒體途徑介導(dǎo)的。以上研究表明銅死亡可能與肝惡性腫瘤密切相關(guān)，為發(fā)現(xiàn)HCC的新治療方法提供了途徑。

本研究探討HCC中銅死亡相關(guān)基因（cuproptosis-related genes，CRGs）的分子改變和臨床相關(guān)性，為銅死亡調(diào)節(jié)因子在HCC中的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集來源及預(yù)處理

從TCGA（The Cancer Genome Atlas，https://portal.gdc.cancer.gov）數(shù)據(jù)庫中收集HTseq-FPKM格式的424例HCC患者的樣本基因表達(dá)及相關(guān)臨床信息，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化得到TPM格式的RNAseq數(shù)據(jù)。CRGs來源于近期的兩項(xiàng)報(bào)道[15,19]，分別為SLC31A1、PDHB、PDHA1、NLRP3、NFE2L2、MTF1、LIPT1、LIPT2、LIAS、GLS、GCSH、FDX1、DLD、DLST、DBT、DLAT、CDKN2A、ATP7A和ATP7B，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化后基因表達(dá)矩陣得到CRGs表達(dá)矩陣文件。所有的基因特征(如染色體位置、基因類型、集成id和官方符號)均由基因編碼項(xiàng)目（v22）進(jìn)行注釋[20]。臨床協(xié)變量，包括總生存（overall survival，OS）結(jié)局、年齡、性別、腫瘤分期和組織學(xué)分級，均來自先前的相關(guān)資源[21]。本研究僅納入有生存信息的HCC患者。

1.2 差異表達(dá)分析與突變分析

分析腫瘤和正常樣本之間CRGs表達(dá)水平的差異，以P＜0.05且｜log2FC｜＞2/3為差異表達(dá)基因的閾值。為了獲得CRGs的突變圖，使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫（http://www.cbioportal.org）進(jìn)行基因突變分析。

1.3 CRGs網(wǎng)絡(luò)富集分析和蛋白質(zhì)間的相互作用分析

采用“clusterProfiler”包[22]對19個的CRGs進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。GO分析包括生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分 （cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。為了分析這些基因的潛在相互作用，使用GENEMANIA（http://genemania.org）網(wǎng)站[23]進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

1.4 預(yù)后模型的構(gòu)建

采用單因素Cox分析篩選預(yù)后相關(guān)基因，采用“glmnet”包進(jìn)行Lasso-Cox回歸分析得到3個基因用于構(gòu)建預(yù)后評分模型。患者風(fēng)險(xiǎn)評分=∑（每個基因表達(dá)水平×相應(yīng)系數(shù)）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分的中位數(shù)將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。用R包“ggsurvplot”比較高危組和低危組的OS，繪制Kaplan-Meier生存曲線。使用R包“survival ROC”計(jì)算受試者工作特征（ROC）曲線分析檢驗(yàn)獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素預(yù)測生存率的敏感度和特異度，評估模型預(yù)測準(zhǔn)確性。經(jīng)過多因素Cox分析，納入年齡、性別、T分期、N分期、M分期、病理分型、CDKN2A、GLS和DLAT等變量，采用R包“regplot”構(gòu)建HCC患者列線圖，使用R包“rms”進(jìn)行分析繪制校準(zhǔn)曲線。

1.5 與免疫浸潤的相關(guān)性分析

利用TIMER數(shù)據(jù)庫（cistrome.shinyapps.io/timer）[24]研究CRGs的表達(dá)與6種免疫細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）豐度以及免疫檢查點(diǎn)PDCD1、CD274、HAVCR2之間的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對TCGA中的HCC患者進(jìn)行了描述性統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）統(tǒng)計(jì)，分類變量用頻率和比例統(tǒng)計(jì)。采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)[25]檢測HCC患者在不同分類的病理分期和組織學(xué)分級中CRGs表達(dá)的差異。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用R版本4.1.1進(jìn)行。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCC中CRGs的差異表達(dá)及基因突變情況

從TCGA下載數(shù)據(jù)中比較腫瘤和正常組織之間的差異表達(dá)基因，結(jié)果顯示，19個CRGs中，PDHB、PDHA1、MTF1、LIPT1、LIPT2、LIAS、GLS、DLD、DLST、DLAT、CDKN2A和ATP7A在腫瘤組織中高表達(dá)；SLC31A1、GCSH、DBT、NLRP3在腫瘤組織中低表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖1A-B）。此外，不同基因表達(dá)之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（圖1C），MTF1與ATP7A呈高度正相關(guān)（r=0.729，P＜0.001）（圖1D）；19個CRGs中NLRP2的突變頻率最高，為12%（圖1E）。

圖1 HCC中CRGs的表達(dá)和基因改變 A-B：在HCC和正常組織中19個CRGs的表達(dá)；C-D：CRGs表達(dá)之間的相關(guān)性；E：HCC中19個CRGs的突變頻率Figure 1 Expression and genetic alteration of CRGs in HCC A-B: Expressions of 19 CRGs in HCC and normal tissues; C-D:Correlations between the expression of CRGs; E: Mutation frequencies of 19 CRGs in HCC

2.2 CRGs的功能富集和蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析

為驗(yàn)證CRGs的生物學(xué)功能，進(jìn)行GO和KEGG的功能富集分析。參與的BP包括TAC、檸檬酸代謝、乙酰輔酶A的代謝、TCA的代謝過程、丙酮酸對乙酰輔酶A的生物合成；參與的CC包括線粒體基質(zhì)、氧化還原酶復(fù)合物、二氫脂酰脫氫酶復(fù)合物、TAC酶復(fù)合物、晚期胞內(nèi)體；參與的MF包括具有氧化還原酶活性，作用于供體的醛或氧基，NAD或NADP作為受體、具有轉(zhuǎn)移酶活性的轉(zhuǎn)移?；⑦^渡金屬離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、除氨基?；酝饩哂修D(zhuǎn)移酶活性的?；?。KEGG包括TCA循環(huán)、碳代謝作用、丙酮酸代謝、糖酵解/糖異生和鉑類藥物耐藥性。通過PPI分析CRGs的相互作用，結(jié)果顯示DLD、DLST、DLAT和PDHA1是樞紐基因（圖2）（表1）。

表1 CRGs的GO和KEGG的功能富集分析Table 1 Functional enrichment analysis of GO and KEGG for CRGs

圖2 TCGA-HCC患者CRGs的GO/KEGG富集和PPI分析 A：CRGs參與的BP；B：CRGs參與的CC；C：CRGs發(fā)揮的MF；D：KEGG通路；E：HCC中CRGs的相互作用蛋白Figure 2 GO/KEGG enrichment and PPI analysis of CRGs in TCGA-HCC patients A: BP associated with CRGs; B: CC associated with CRGs; C: MF played by CRGs; D: KEGG pathway; E: Interacting proteins of CRGs in HCC

2.3 CRGs預(yù)后模型的構(gòu)建

進(jìn)一步評估HCC中CRGs表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，在調(diào)整年齡、性別、種族和病理分期后，在單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中，PDHA1（HR=1.467，95%CI=1.036～2.077）、DLST（HR=1.505，95%CI=1.063～2.131）、DLAT（HR=1.689，95%CI=1.191～2.396）、ATP7A（HR=1.432，95%CI=1.013～2.024）、CDKN2A（HR=1.790，95%CI=1.262～2.538）和GLS（HR=1.592，95%CI=1.124～2.255）與OS相關(guān)（均P＜0.05），其過表達(dá)與HCC患者較差的生存率相關(guān)，顯示出致癌因子的特征（表2）。

表2 CRGs單因素Cox回歸分析Table 2 Univariate Cox regression analysis of the CRGs

利用Lasso-Cox回歸分析構(gòu)建了HCC中CRGs關(guān)于OS的預(yù)后模型。以O(shè)S為結(jié)局得到3個基因，使用其回歸系數(shù)構(gòu)建預(yù)后評分：風(fēng)險(xiǎn)評分=0.22×DLAT+0.11×CDKN2A+0.03×GLS（圖3）。

圖3 TCGA-HCC隊(duì)列CRGs預(yù)后模型構(gòu)建Figure 3 Prognostic model construction of CRGs in the TCGA-HCC cohort

以風(fēng)險(xiǎn)評分中位數(shù)為臨界值，將TCGA-HCC隊(duì)列患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組（n=159）和低風(fēng)險(xiǎn)組（n=158）。高風(fēng)險(xiǎn)組患者生存時間較低風(fēng)險(xiǎn)患者生存時間縮短（圖4A）；Kaplan-Meier曲線顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組生存時間縮短（HR=1.90，95%CI=1.34～2.70，P＜0.001）（圖4B）；ROC曲線評價(jià)模型預(yù)測性能，曲線下面積（AUC）在1年時達(dá)到0.741，3年時達(dá)到0.657，5年時達(dá)到0.633（圖4C）。

圖4 TCGA HCC患者CRGs的臨床相關(guān)性 A：CRGs風(fēng)險(xiǎn)評分、生存狀態(tài)和預(yù)后的分布；B：Kaplan-Meier曲線；C：ROC的1、3、5年生存期預(yù)測Figure 4 Clinical relevance of CRGs in TCGA HCC patients A: Distribution of risk score, survival status and prognosis of CRGs; B: Kaplan Meier diagram; C: The 1-, 3- and 5-year survival prediction of ROC

2.4 列線圖的開發(fā)與驗(yàn)證

為了便于預(yù)測模型的臨床應(yīng)用，整合TCGA患者的臨床信息和基因特征，采用多變量Cox回歸將年齡、性別、T分期、N分期、M分期、病理分型、CDKN2A、GLS和DLAT納入來建立列線圖（圖5）。對OS結(jié)果采用了鑒別和校準(zhǔn)方法（圖6A）。OS的C指數(shù)為0.696（0.663～0.728），反映了列線圖相對較好的預(yù)測性能。同時，校準(zhǔn)圖顯示，在生存1、3、5年時，預(yù)測的OS與觀察到的OS之間具有良好的一致性（圖6B）。

圖5 銅死亡相關(guān)預(yù)后生物標(biāo)志物的單因素和多因素Cox回歸分析 A：單因素Cox回歸分析；B：多因素Cox回歸分析Figure 5 Univariate and multivariate Cox regression of Cuproptosis-Related prognostic biomarkers A: Univariate Cox regression; B: Multivariate Cox regression

圖6 預(yù)測HCC患者1、3、5年OS的列線圖和校準(zhǔn)曲線 A：列線圖；B：列線圖預(yù)測的校準(zhǔn)曲線Figure 6 Nomograms and calibration curves predicting 1-, 3- and 5-year OS of HCC patients A: Nomograms; B: Calibration curves predicted by the nomograms

2.5 HCC中CRGs的表達(dá)與免疫浸潤水平的相關(guān)性

目前尚不清楚CRGs是否會影響腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞招募，從而影響HCC的預(yù)后。因此，本研究分析了GLS、DLAT和CDKN2A與HCC中免疫浸潤的關(guān)系。GLS、DLAT和CDKN2A的表達(dá)水平與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的免疫浸潤水平均呈正相關(guān)（均P＜0.05）（圖7）。結(jié)果還顯示，HCC中GLS的表達(dá)與PDCD1、CD274、HAVCR2的表達(dá)水平呈正相關(guān)（均P＜0.05）；DLAT的表達(dá)與CD274和HAVCR2的表達(dá)水平相關(guān)（均P＜0.05）；CDKN2A的表達(dá)與PDCD1、CD274和HAVCR2的表達(dá)相關(guān)（均P＜0.05）（圖8）。

圖7 TIMER數(shù)據(jù)庫中的CRGs表達(dá)與免疫浸潤的相關(guān)性 A：GLS；B：DLAT；C：CDKN2AFigure 7 Correlation between the expressions of CRGs and immune infiltration in the TIMER database A: GLS; B: DLAT;C: CDKN2A

圖8 HCC患者CRGs表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)（PDCD1、CD274、HAVCR2）表達(dá)的相關(guān)性 A：GLS；B：DLAT；C：CDKN2AFigure 8 Correlations between the expressions of CRGs and the expressions of immune checkpoints (PDCD1, CD274 and HAVCR2) A: GLS; B: DLAT; C: CDKN2A in HCC patients

2.6 HCC在不同病理階段和組織學(xué)分級中CRGs的差異表達(dá)

如圖9所示，無論腫瘤分期和組織學(xué)分級如何，GLS、DLAT和CDKN2A的表達(dá)均呈上升趨勢。在腫瘤分期中，GLS、DLAT和CDKN2A在I、Ⅲ期的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），CDKN2A在I、Ⅱ、Ⅲ期的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖9A-C）。在組織學(xué)分級中，除DLAT在組織學(xué)分級中表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＞0.05），GLS、CDKN2A在HCC的組織學(xué)分級中的表達(dá)水平存在差異（均P＜0.05）（圖9D-F）。以上結(jié)果表明，GLS、DLAT和CDKN2A的表達(dá)水平可能與HCC的不良預(yù)后密切相關(guān)。

圖9 GLS、DLAT和CDKN2A在不同病理特征HCC患者中的表達(dá) A-C：不同病理分期；D-F：不同組織學(xué)分級Figure 9 Expressions of GLS, DLAT and CDKN2A in HCC patients with different pathological characteristics A-C:Different Pathological stages; D-F: Different histological grades

3 討 論

銅死亡是最近新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞內(nèi)游離銅積累，蛋白質(zhì)脂化導(dǎo)致細(xì)胞毒性應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的形式[15]。目前銅死亡在HCC中的相關(guān)機(jī)制研究較少。HCC患者發(fā)現(xiàn)時間較晚，治療潛力有限，病死率高，使開發(fā)穩(wěn)定的預(yù)后指標(biāo)變得非常重要。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)建立了一個包含3個基因的銅死亡相關(guān)評分模型預(yù)測HCC預(yù)后，高風(fēng)險(xiǎn)評分組HCC患者生存期短于低風(fēng)險(xiǎn)評分組。此外，風(fēng)險(xiǎn)評分是HCC患者獨(dú)立的預(yù)測因子，與臨床特征和免疫功能密切相關(guān)。

本研究通過對19個CRGs的功能分析，PDHB、PDHA1、MTF1、LIPT1、LIPT2、LIAS、GLS、DLD、DLST、DLAT、CDKN2A和ATP7A等大多數(shù)基因在HCC組織中高表達(dá)；LC31A1、GCSH、DBT和NLRP3在HCC組織中低表達(dá)，這些結(jié)果均未見報(bào)道。CDKN2A的表達(dá)在細(xì)胞周期控制中起作用，并與多種腫瘤的起源密切相關(guān)[26-29]。既往研究[30]顯示，CDKN2A在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)上調(diào)，可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。尚未有其他研究闡明CRGs在HCC中的表達(dá)和功能。相關(guān)分析表明，大部分CRGs之間呈正相關(guān)。GLS和PDHA1在促進(jìn)前列腺癌患者更大的谷氨酰胺依賴方面發(fā)揮了協(xié)同作用[31]。此外，PDHA1、PDHB、DLAT和DLD在丙酮酸脫氫酶復(fù)合物缺乏癥中發(fā)揮了協(xié)同作用[32]。GO和KEGG分析顯示，CRGs在TCA循環(huán)、碳代謝作用、丙酮酸代謝、糖酵解/糖異生和鉑類藥物耐藥性通路中富集，顯示CRGs對于HCC的進(jìn)展，預(yù)后以及化療耐藥性等方面具有重要意義。

進(jìn)一步預(yù)后分析顯示，GLS、DLAT和CDKN2A水平較高的HCC患者OS較低，表明GLS、DLAT和CDKN2A是HCC潛在的不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。有研究[33]表明GLS可以差異地調(diào)節(jié)人類癌癥的預(yù)后。另一項(xiàng)研究[34]也表明CDKN2A可作為人類子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后生物標(biāo)志物。Chen等[35]發(fā)現(xiàn)LIPT1與尿路上皮癌的生存率相關(guān)。越來越多的證據(jù)[36]表明，較低水平的PDHA表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解和惡性程度顯著相關(guān)。此外，本研究進(jìn)行了Lasso-Cox回歸分析，建立了一個包括GLS、DLAT和CDKN2A等與預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物的生存模型，它們在預(yù)測HCC患者的預(yù)后方面具有良好的表現(xiàn)。

在免疫浸潤分析結(jié)果顯示，CDKN2A、GLS和DLAT的表達(dá)與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的豐度呈正相關(guān)。有研究[37]報(bào)道在HCC中，CDKN2A的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)，CDKN2A通過影響腫瘤免疫微環(huán)境促進(jìn)HCC進(jìn)展。另一項(xiàng)整合生物信息學(xué)分析[38]顯示，CDKN2A與多發(fā)性骨髓瘤中的CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、T細(xì)胞衰竭和中性粒細(xì)胞等免疫信號顯著相關(guān)。也有研究[39]表明，STAT5和CDKN2A/CDKN2B可促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的增殖和終末分化。Colliou等[40]則通過相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，DLAT基因的表達(dá)可顯著增加腸道Th17細(xì)胞，從而預(yù)防相關(guān)炎癥疾病。

綜上所述，本研究結(jié)果對于后續(xù)銅死亡在HCC的基礎(chǔ)研究具有一定的參考價(jià)值，可在一定程度上減少實(shí)驗(yàn)中的浪費(fèi)。但研究仍存在一定的局限性：第一，盡管篩選了HCC銅死亡預(yù)后基因并建立了預(yù)后模型，但沒有進(jìn)一步驗(yàn)證，這是迫切需要在未來進(jìn)行的研究；第二，所采用的芯片數(shù)據(jù)雖然已滿足研究所需的樣本量，但仍有可能因樣本量過少從而導(dǎo)致結(jié)果存在一定偏倚；第三，盡管已經(jīng)篩選出HCC相關(guān)的銅死亡基因，但未能闡明其具體作用機(jī)制，這有待后續(xù)研究進(jìn)一步深入挖掘。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。