劉興剛，張文芳，張丹丹，崔松奇，田春利，余海濤，張 娜

(豪威生物科技有限公司，天津 301700)

0 引言

SPF種蛋作為各類疫苗生產(chǎn)的主要原材料，其質(zhì)量的好壞對產(chǎn)品的有效性與安全性具有決定性的影響。許多蛋傳疾病，如網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)、禽貧血病毒(CAV)等可造成免疫抑制，從而導(dǎo)致雞群免疫失敗。如果使用有蛋傳病毒的原材料生產(chǎn)活疫苗或減毒疫苗，會造成對疫苗的污染，進而造成接種雞群的感染。蛋傳疾病大多數(shù)有水平傳播的能力，可在雞群中擴散。如種禽群感染，再通過水平傳播和垂直傳播，后代的蛋傳疾病將無法控制[1]。因此需要對SPF種蛋進行質(zhì)量監(jiān)控，建立一套有效的種蛋質(zhì)量控制體系，以降低生產(chǎn)疫苗的外源污染風(fēng)險[2]。

1 材料

SPF種蛋：北京(A)和山東(B)兩家供應(yīng)商種蛋。

其他蛋：由市場購買的普通蛋、品牌1、品牌2的受精蛋和已知陽性雞群的非受精蛋。

孵化箱：海江孵化設(shè)備廠。

ELISA試劑盒：美國愛德士(IDEXX)生物科技有限公司。

高速離心機：Thermo ，Legend Micro 17R。

酶標儀：賽默飛世爾(上海)儀器有限公司，multiskan MK3。

PCR試劑盒：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

PCR儀：Applied Biosystems公司。

瓊脂糖(西班牙)：北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。

電泳儀：Tanon天能，EPS300。

凝膠成像儀：BioDoc-It? Imaging System美國UVP。

2 實驗方法

2.1 種蛋的常規(guī)檢測

外觀與潔凈度評價，表面應(yīng)潔凈且無砂皮、畸形、破損，蛋形指數(shù)0.7～0.8(橫徑/縱徑)，不合格率應(yīng)小于2%。

蛋重，每批種蛋隨機抽取30枚稱重，重量在50～70 g/枚為合格。

孵化率，38 ℃孵化至10日齡，去除無精蛋與死胚，孵化率應(yīng)不小于90%。

2.2 4種蛋傳病毒的ELISA法檢測

2家SPF種蛋供應(yīng)商的種蛋每批隨機抽樣30枚，同時從市場上抽取樣本作為對比。分別對網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)、禽貧血病毒(CAV)、禽呼腸孤病毒(REO)4種蛋傳病毒進行檢測[3]。

2.2.1 樣品處理

蛋清樣品，敲開蛋殼，吸取1 mL蛋清于離心管中，反復(fù)凍融3次作為被檢樣品。提取卵抗，離心管中先加入0.6 mL生理鹽水。

1)直接提取法。取0.6 mL卵黃與生理鹽水混合均勻，4 ℃靜置24 h后，收集上清液，3 000 r/min離心5 min，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2)氯仿提取法。0.3 mL卵黃加入0.6 mL生理鹽水中，再加900 μL 氯仿，充分振蕩后，37 ℃水浴30 min，期間搖晃2～3次，然后4 000 r/min離心20 min，取上層水相，即為卵黃抗體待檢樣本[4]。

2.2.2 4種蛋傳病毒的檢測

2.2.2.1 網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)的檢測

據(jù)SPF雞血清REV檢測方法，采取直接提取卵黃與氯仿提取，用美國IDEXX公司的REV-Ab ELISA檢測試劑盒分別檢驗[5]。檢測之前用樣品稀釋液將被檢樣品進行500倍稀釋。

2.2.2.2 禽白血病病毒(ALV)的檢測

ALV抗原檢測，取蛋清樣品直接加樣，按照ELISA診斷試劑盒操作程序進行。ALV-A、B亞群及J亞群抗體檢測，取卵黃抗體樣品，用稀釋液將被檢樣品進行500倍稀釋，按照ELISA診斷試劑盒操作程序進行。

2.2.2.3 禽貧血病毒(CAV)的檢測

建立酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測SPF種蛋雞傳染性貧血病毒抗體方法。卵黃抗體采取直接提取法和氯仿提取法分別檢測，卵黃抗體做10倍稀釋，按照ELISA診斷試劑盒操作程序進行。

2.2.2.4 禽呼吸腸孤病毒(REO)的檢測

卵黃抗體采取直接提取法和氯仿提取法分別檢測，卵黃抗體500倍稀釋，按照ELISA診斷試劑盒操作程序進行。

2.3 4種蛋傳病毒的PCR方法檢測

2.3.1 引物合成

根據(jù)GenBank公司已登錄的蛋傳病毒序列設(shè)計相應(yīng)引物，由上海生物工程有限公司合成。

2.3.2 樣品制備

每組雞蛋隨機取10枚，孵化至10日齡，制備成雞胚成纖維細胞，作為一個混合樣品，培養(yǎng)7 d進行一次傳代，繼續(xù)培養(yǎng)7 d后凍融2次，采用PCR 法檢測培養(yǎng)的細胞中是否存在相應(yīng)病毒特異性基因。

2.3.3 DNA/RNA提取

按提取試劑盒操作程序進行，提取DNA/RNA。

2.3.4 反轉(zhuǎn)錄(ALV、REO)

按順序加入10 μL 2xES Reaction Mix，1 μL Random primer(N9)，1 μL Easy ScriptRT/RI Enzyme Mix，8 μLRNA 。輕輕混勻，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 s失活。

2.3.5 PCR反應(yīng)

1)按順序加入37 μL dd H2O，4 μL 2.5 mM dNTPs，5 μL 10 X EasyTaq Buffer，1 μL Forward Primer(10 μM)，1 μL Reverse Primer(10 μM)，混合均勻后分裝24 μL/管，每管加入0.5 μL模板，0.5 μL DNA聚合酶。

2)檢測4種蛋傳病毒的反應(yīng)程序具體如表1、表2、表3所示。

表1 ALV、CAV檢測反應(yīng)程序

表2 REV檢測反應(yīng)程序

表3 REO檢測反應(yīng)程序

3 結(jié)果

3.1 種蛋質(zhì)量的常規(guī)檢驗結(jié)果

種蛋質(zhì)量的常規(guī)檢驗結(jié)果，如表4所示。

表4 種蛋質(zhì)量的常規(guī)檢驗結(jié)果

檢驗結(jié)果表明，2家供應(yīng)商的SPF種蛋從外觀、蛋重、孵化率幾方面評價，符合公司對SPF種蛋質(zhì)量的一般要求。

3.2 4種蛋傳病毒的ELISA檢測結(jié)果

1)對2家供應(yīng)商的SPF種蛋進行檢測，卵黃抗體采用直接提取法，ALV抗原采用蛋清樣品檢測。結(jié)果如表5所示。

表5 直接提取法SPF種蛋檢測結(jié)果

4種蛋傳病毒采用ELISA法檢測，結(jié)果12批次SPF種蛋全部為陰性，陰、陽性對照成立，實驗結(jié)果成立。說明2家供應(yīng)商的SPF種蛋無上述4種蛋傳病毒感染。

2)對市場購進的普通蛋、品牌蛋以及已知陽性雞群的雞蛋進行檢測，對卵黃抗體采用直接提取法，ALV抗原采用蛋清樣品檢測。檢測結(jié)果如表6所示。

表6 市場購買蛋直接提取卵黃抗體檢測結(jié)果

市場購買蛋直接提取卵黃抗體進行檢測，5批次市場購買種蛋部分陽性，已知陽性雞群的雞蛋陽性檢出率較高，試驗陰、陽性對照成立，實驗結(jié)果成立。

3)采用直接提取法與氯仿提取卵黃抗體，CAV、REV、REO的檢測結(jié)果對比如表7所示。直接提取法與氯仿提取CAV、REV、REO卵黃抗體的檢測對比，結(jié)果差異不明顯。

表7 直接提取法與氯仿提取CAV、REV、REO卵黃抗體的檢測結(jié)果

4)采用直接提取法與氯仿提取卵黃抗體，ALV的檢測結(jié)果對比如表8所示。直接提取法與氯仿提取ALV卵黃抗體的檢測相對比，結(jié)果差異不明顯。

表8 直接提取法與氯仿提取ALV卵黃抗體的檢測結(jié)果

3.3 4種蛋傳病毒的PCR檢測結(jié)果

4種蛋傳病毒的PCR檢測結(jié)果如表9所示。

表9 PCR法檢測結(jié)果

PCR檢測陰性對照、陽性對照成立，實驗結(jié)果成立。ELISA 法檢測陰性的12批SPF種蛋孵化成雞胚制備的雞胚成纖維細胞PCR法檢測結(jié)果也均為陰性，ELISA檢測陽性的種蛋，對應(yīng)批次種蛋PCR檢測也為陽性，2種檢驗方法的檢測結(jié)果符合率較好。

電泳結(jié)果如圖1～4所示。

圖1 REV檢測結(jié)果

圖2 CAV檢測結(jié)果

圖3 REO檢測結(jié)果

圖4 ALV-B亞型檢測結(jié)果

4 討論

4.1 種蛋的常規(guī)檢測

檢驗結(jié)果表明，2家供應(yīng)商的SPF種蛋從外觀、蛋重、孵化率幾方面評價，符合對種蛋質(zhì)量的一般要求。該檢驗方法簡單可行，可用于種蛋質(zhì)量的日常監(jiān)測。

4.2 4種蛋傳病毒的ELISA法檢測

4種蛋傳病毒采用ELISA法檢測，結(jié)果12批次SPF種蛋全部為陰性，5批次市場購買種蛋部分陽性，已知陽性雞群的雞蛋陽性檢出率較高，試驗陰、陽性對照成立，實驗結(jié)果成立。ELISA法檢測4種蛋傳病毒，技術(shù)成熟可靠，方法簡單快速，可應(yīng)用于實際工作中的種蛋質(zhì)量監(jiān)測。

卵黃抗體直提法和氯仿提取抗體的方法在檢測結(jié)果上差異不明顯。直提法有操作易行、檢測周期短、工作效率高的特點，可作為優(yōu)選方法。

4.3 4種蛋傳病毒的PCR法檢測

PCR檢測陰性對照、陽性對照成立，實驗結(jié)果成立。ELISA 法檢測陰性的12批SPF種蛋孵化成雞胚制備的雞胚成纖維細胞PCR法檢測結(jié)果也均為陰性，ELISA檢測陽性的種蛋，對應(yīng)批次種蛋PCR檢測也為陽性，2種檢驗方法的檢測結(jié)果符合率較好。

用ELISA方法和PCR法均可以對種蛋的外源病毒進行檢測，ELISA方法簡單快速，靈敏度好。PCR方法靈敏度更高，但種蛋須孵化10 d再制備雞胚成纖維細胞，培養(yǎng)14 d后再進行檢驗，時效性差。所以可以優(yōu)先使用ELISA方法檢測，發(fā)現(xiàn)陽性或可疑的結(jié)果可使用PCR復(fù)檢。

5 結(jié)論

本試驗對種蛋外觀、蛋重及孵化率的檢測方法簡單可行，可用于種蛋質(zhì)量的日常監(jiān)測。ELISA方法和PCR法對4種蛋傳病毒的檢測，實驗結(jié)果均成立，且檢測結(jié)果符合率較好。優(yōu)先使用ELISA方法用于種蛋質(zhì)量檢測，方法簡便，時效性好，若發(fā)現(xiàn)陽性或可疑的結(jié)果可使用PCR復(fù)檢。本試驗建立了一套在實際工作中可操作性強、結(jié)果可靠的種蛋質(zhì)量檢測方法，可以對SPF種蛋質(zhì)量進行有效把關(guān)，進而更好地保證疫苗產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)風(fēng)險。