劉子銘，王文靜，朱鵬超，朱錦璐，丁宇航，韓明洋，王曉龍,2

(1山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355;2山東中醫(yī)藥大學實驗中心，濟南 250355)

急性肺損傷(ALI)是臨床常見的呼吸系統(tǒng)疾病[1]，目前研究主要在與ALI的發(fā)展和進展有關的血漿和分子生物標志物上，但因其發(fā)病機制較為復雜，目前治療效果尚不理想。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調能夠誘導多種疾病產(chǎn)生[2-3]，而肺部疾病也會導致腸道菌群的失調，進而影響腸黏膜結構與功能[4]。生姜汁(ZOS)可以調節(jié)腸道菌群結構、豐富菌群豐度、增加菌群多樣性，以緩解炎癥、恢復腸道微環(huán)境[5-6]。因此，本研究基于16S rDNA技術，探討ZOS對脂多糖(LPS)誘導急性肺損傷小鼠腸道菌群影響，進而分析腸道菌群對急性肺損傷的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

取SPF 級Balb/c雄性小鼠，6～8 w齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2021-0006。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學 SPF 級動物房，觀察小鼠生長情況，按時更換墊料、飼料及飲用水。本實驗經(jīng)山東中醫(yī)藥大學醫(yī)學與實驗動物倫理委員會審查通過。

1.2 藥物與試劑

ZOS(自制，由鮮生姜榨汁后，進行過濾制備而成)；異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，貨號R510-22-16)；LPS(美國sigma公司，貨號L2880)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(上海源培生物科技股份有限公司，貨號B310KJ)。

1.3 儀器

電子天平(EX225ZH/AD)，奧豪斯儀器有限公司；榨汁機(型號KP60SB),廣東科嘉霖電器制造有限公司；增強型小動物麻醉機(型號R540IE),深圳市瑞沃德生命科技有限公司；Illumina MiSeqPE300測序平臺,由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供。

2 方法

2.1 ZOS制備

取適量新鮮生姜，去皮洗凈，切成小塊，加入適量生理鹽水榨汁，4層紗布過濾，制成3 g/mL的ZOS，每日現(xiàn)榨現(xiàn)用。

2.2 動物分組及給藥

將Balb/c小鼠按體重分為對照組、LPS模型組、ZOS組。ZOS組通過灌胃方式給予ZOS 3 g/mL，對照組、LPS模型組灌胃生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥14 d。

2.3 LPS誘導急性肺損傷小鼠模型建立

電子天平稱取適量LPS粉末，以無菌PBS稀釋為2.5 mg/mL，采用異氟烷呼吸麻醉的方式將小鼠麻醉，對照組小鼠鼻腔滴入20 μL生理鹽水，其余組小鼠鼻腔滴入2.5 mg/mL的LPS 20 μL，完成造模。

2.4 糞便收集及腸道菌群檢測

實驗動物造模后禁食不禁水12 h。輕輕抓握小鼠刺激排便，并迅速用無菌EP管接取糞便，每只小鼠取2粒，迅速轉移至-80 ℃保存。獲得糞便樣本共15個，每組5個，DNA提取及Illumina Miseq PE300測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

2.5 肺指數(shù)

小鼠取糞便后處死，摘取全肺，剔除結締組織，萬分之一電子天平稱定質量并計算肺指數(shù)(肺重/體重)。

2.6 測序分析

測序數(shù)據(jù)通過美吉公司云平臺微生物多樣性QIIME2流程進行分析。根據(jù)擴增子序列變異(ASV)對腸道菌群進行Alpha 多樣性分析等。為研究不同樣本間的差異關系，找出不同組間在豐度上的差異物種，進行 Beta 多樣性、LEfSe 分析等。

2.7 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析，使用Graphpad Prism 8.0.2軟件，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

3 結果與分析

3.1 ZOS對急性肺損傷小鼠肺指數(shù)的影響

相比于對照組，模型組肺指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，ZOS組肺指數(shù)明顯下降(P<0.05)，表明給予ZOS后，可改善肺損傷情況(圖1、附表)。

附表 ZOS對急性肺損傷小鼠肺指數(shù)的影響

圖1 ZOS對急性肺損傷小鼠肺指數(shù)的影響

3.2 數(shù)據(jù)質控及ASV分析

糞便樣本共15個，共獲得優(yōu)化序列710 298條，所測樣本中最高序列條數(shù)55 641，最低序列條數(shù)36 286。使用DADA2方法降噪后共生成822個ASV，按樣本最低序列條數(shù)進行抽平處理，得到822個ASV。在ASV水平上對不同樣本間的異同進行統(tǒng)計，并通過Venn圖展現(xiàn)不同樣本之間共有或特有的ASVs。對照組ASV 506個、模型組ASV 584個、ZOS組ASV 556個，這提示，LPS感染小鼠菌群多樣性升高，給予生姜汁治療后，小鼠菌群多樣性降低；對照組與模型組非共有的ASV 340個，表明LPS感染小鼠糞便菌群組成發(fā)生顯著變化；ZOS組與模型組非共有ASV 358個，對照組與ZOS組非共有ASV 334個，表明給予ZOS后可以降低糞便菌群多樣性(圖2)。

圖2 各組菌群的ASV分布

3.3 Alpha多樣性分析

3.3.1 稀釋性曲線分析 隨機抽取樣本，計算并作圖，其中 X 軸代表每個樣本隨機抽取的序列條數(shù)、Y 軸代表Sobs指數(shù)，當曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量合適。圖3結果表明，每個樣本隨機抽取的序列條數(shù)與Sobs指數(shù)曲線均趨向于平坦狀態(tài)，表明各組小鼠糞便樣本取樣數(shù)量合理。

圖3 稀釋性曲線分析圖

3.3.2 Alpha多樣性指數(shù)分析 相比于對照組，模型組群落豐富度有上升趨勢；而相比于模型組，ZOS組群落豐富度下降。結果提示，ZOS具有改善急性肺損傷小鼠腸道菌群的多樣性的作用(圖4、圖5)。

圖4 Alpha多樣性指數(shù)柱形圖

圖5 Alpha多樣性指數(shù)組間差異檢驗箱式圖

3.4 Beta多樣性分析

3.4.1 PCA與PCoA分析 如圖6所示，模型組與對照組、ZOS組距離均較遠，認為模型組與其余2組的腸道菌群種類具有明顯差異；并且ZOS組與對照組菌群結構距離相近，表明在給予ZOS治療后，可明顯改善急性肺損傷小鼠腸道內菌群，使之趨于正常。

圖6 PCA與PCoA分析

3.4.2 Hcluster分析 圖7結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠腸道菌群發(fā)生明顯變化，而ZOS可以改善急性肺損傷小鼠腸道菌群的結構，使之趨于對照組。

圖7 UPGMA層次聚類分析圖

3.5 物種分析

3.5.1 門水平(Phylum)物種組成分析 圖8結果顯示，各樣本在門水平上相比，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)的菌群表現(xiàn)出較高的豐度。相比于對照組，LPS模型組腸道菌群中有2種菌群豐度有較為明顯變化，厚壁菌門菌群豐度上升，擬桿菌門菌群豐度降低。而ZOS組中表現(xiàn)出與模型組截然相反的情況，厚壁菌門豐度降低，擬桿菌門菌群豐度上升。上述結果表明，ZOS可以改善LPS誘導急性肺損傷小鼠腸道中厚壁菌門和擬桿菌門的菌群豐度。

圖8 糞便菌群門水平相對豐度圖

3.5.2 目水平(Order)物種組成分析 圖9結果顯示，各組樣品中主要包括7個目，分別是擬桿菌目(Bacteroidales)、乳螺目(Lachnospirales)、梭菌目UCG-014(Clostridia_UCG-014)、振螺目(Oscillospirales)、乳桿菌目(Lactobacillales)、Clostridia_vadinBB60_group、脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)，其中排名前4位的是擬桿菌目、乳螺目、梭菌目UCG-014和振螺目。與對照組相比，模型組小鼠中擬桿菌目、乳螺目菌群豐度降低，梭菌目和振螺目菌群豐度升高；給予ZOS后，小鼠糞便中擬桿菌目菌群豐度升高，梭菌目菌群豐度降低。

圖9 糞便菌群目水平相對豐度柱狀圖

3.5.3 屬水平(Genus)物種組成分析 圖10結果顯示，樣本中細菌群落組成中包括的菌屬有19種，分別為Muribaculaceae、Clostridia_UCG-014、Lachnospiraceae、乳桿菌屬(Lactobacillus)、普雷沃氏菌屬UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)、擬桿菌屬(Bacteroides)、毛螺菌屬NK4A136(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、擬普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)、Oscillospiraceae、另支菌屬(Alistipes)、羅氏菌屬(Roseburia)、Muribaculum、Oscillospiraceae、Lachnospiraceae、Clostridia_vadinBB60_group、Ruminococcaceae、理研菌科RC9_gut_group(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、嗜木聚糖真桿菌(Eubacterium_xylanophilum_group)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)。與對照組相比，模型組中Muribaculaceae、Lachnospiraceae、乳桿菌屬、擬桿菌屬、毛螺菌屬NK4A136、Muribaculum、Lachnospiraceae、Lachnospiraceae、脫硫弧菌屬菌群豐度有較為明顯的下降趨勢,Clostridia_UCG-014、擬普雷沃氏菌屬、Oscillospiraceae、Eubacterium_xylanophilum_group菌群豐度有明顯上升趨勢。與模型組相比，ZOS組Muribaculaceae、Lachnospiraceae、普雷沃氏菌科UCG- 001、擬桿菌屬、擬普雷沃氏菌屬、Oscillospiraceae、Clostridia_vadinBB60_group、Ruminococcaceae菌群豐度有上升趨勢,Clostridia_UCG-014、毛螺菌科NK4A136、羅氏菌屬、Lachnospiraceae、嗜木聚糖真桿菌的菌群豐度有明顯下降趨勢，提示給予ZOS后，可明顯改善急性肺損傷小鼠腸道菌群豐度，使之趨于對照組。

圖10 糞便菌群屬水平相對豐度圖

3.5.4 Heatmap分析 菌群Heatmap分析結果表明，對照組與模型組菌群結構有明顯不同，提示肺損傷可改變菌群結構，造成腸道菌群失調，與模型組相比，ZOS組小鼠的腸道菌群結構有所改善(圖11)。

圖11 水平菌群 Heatmap 分析

3.6 LEfSe分析

該方法設定 LDA 得分值>4找到組間豐富度存在顯著差異的物種。圖12結果表明，與對照組相比，模型組的差異物種主要為厚壁菌門、顫螺旋菌科(Oscillospiraceae)、Clostridia_UCG-014；與模型組相比，ZOS組差異主要表現(xiàn)在擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌門、擬桿菌目、Muribaculaceae、普雷沃氏菌科。

圖12 LEfSe分析

4 討論

生姜對腸道菌群具有多種調節(jié)作用。生姜提取物能顯著抑制金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等[7]菌群的繁殖。生姜中的6-姜酚對幽門螺桿菌具有顯著抑制作用[8]。干姜對腸道菌群也具有調控作用[9]，如對腸桿菌的抑制作用、對腸道乳酸桿菌的促進作用等[10]。本研究通過小鼠滴鼻LPS構建急性肺損傷模型，造模后小鼠肺重及肺指數(shù)明顯增加，腸道菌群多樣性及豐度發(fā)生明顯改變，Muribaculaceae、Lachnospiraceae、乳桿菌屬、擬桿菌屬、毛螺菌屬NK4A136、Muribaculum、Lachnospiraceae、Lachnospiraceae、脫硫弧菌屬菌群豐度明顯下降，Clostridia_UCG-014、擬普雷沃氏菌屬、Oscillospiraceae、Eubacterium_xylanophilum_group菌群豐度明顯上升。經(jīng)ZOS治療后，小鼠的肺重、肺指數(shù)顯著降低，腸道菌群的多樣性及豐度有所改善，Muribaculaceae、Lachnospiraceae、普雷沃氏菌科UCG-001、擬桿菌屬、擬普雷沃氏菌屬、Oscillospiraceae、Clostridia_vadinBB60_group、Ruminococcaceae菌群豐度呈上升趨勢,Clostridia_UCG-014、毛螺菌科NK4A136、羅氏菌屬、Lachnospiraceae、嗜木聚糖真桿菌的菌群豐度有明顯下降趨勢，菌群結構更加穩(wěn)定。提示調節(jié)腸道菌群可能是治療肺損傷的方法之一。

腸道菌群在抵抗病原體，提高機體免疫功能方面能發(fā)揮重要作用[11-12]。腸-肺軸(GLA)具有復雜相互作用及局部和深遠免疫效應的特點[13-14]。Muribaculaceae存在于小鼠腸道中涉及復雜的碳水化合物降解[15]，在降解碳水化合物方面發(fā)揮作用。Lachnospiraceae被認為在代謝性疾病[16]、肝臟疾病[17]、腎病[18]、腸炎[19]及與腸腦軸相關的腸胃失調疾病[20-21]中發(fā)揮重要作用。擬桿菌屬與多種疾病發(fā)生有密切聯(lián)系，如結腸炎[22]、結腸癌[23]等。本研究未明確的部分菌群仍需進一步驗證。