普 冬,余婷婷,李麗華,張潤(rùn)武,武昆利,李冬玲
(昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科/云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心,云南 昆明 650041)
一直以來,我國(guó)人群中因感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)導(dǎo)致的慢性乙肝(chronic hepatitis B,CHB)、肝癌和肝硬化的患者具有較高的比率,已成為嚴(yán)重影響人民健康的公共衛(wèi)生問題[1]。近年來,各國(guó)相繼發(fā)布了多版的CHB 防治指南,均推薦采用高敏乙肝病毒載量檢測(cè)結(jié)果來判斷臨床治療終點(diǎn),該方法檢測(cè)下限為10~12 IU/mL[2-4]。我國(guó)2019 版指南[1]也強(qiáng)調(diào)采用敏感的檢測(cè)方法進(jìn)行HBV DNA 檢查,而國(guó)內(nèi)常規(guī)的方法最低檢測(cè)限幾乎都是 200~1 000 IU/mL,很難滿足臨床診斷的需求。高敏 HBV DNA 檢測(cè)因其高靈敏度、特異性強(qiáng)且具有線性范圍寬、攜帶污染低等優(yōu)點(diǎn),可對(duì)HBV 感染進(jìn)行精準(zhǔn)的檢測(cè),為臨床診治提供有力幫助。同樣,乙肝耐藥基因測(cè)序的原理是通過檢測(cè)其易突變區(qū)域的完整基因序列存在的具體突變情況,進(jìn)一步進(jìn)行序列比對(duì)分析判斷病毒核酸堿基是否突變,是專業(yè)公認(rèn)最直接、可靠的金標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究利用檢測(cè)下限為 20 IU/mL 的高敏 HBV DNA 檢測(cè)技術(shù),Sanger測(cè)序等技術(shù),對(duì)昆明地區(qū)707 例持續(xù)低病毒載量水平的慢乙肝患者,進(jìn)行高敏病毒載量、HBV 的基因型以及耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序檢測(cè),進(jìn)一步探討HBV 低水平病毒血癥患者病毒載量水平、HBV 的基因型分布特點(diǎn)、HBV P 區(qū)耐藥突變位點(diǎn)的特征,同時(shí)結(jié)合HBeAg、HBsAg 及ALT 水平等分析其與高敏 HBV DNA 的關(guān)聯(lián)性,期望為臨床提供治療慢乙肝患者的參考依據(jù),制定出更個(gè)體化的、有效的、精準(zhǔn)的治療方案。
采集2021 年1 月至2021 年12 月期間于昆明市第三人民醫(yī)院就診的707 例持續(xù)低水平HBV DNA 的慢乙肝患者血清標(biāo)本,男449 例,女258 例,年齡19~73 歲,平均55.5 歲。所有患者的診斷標(biāo)準(zhǔn),均符合我國(guó)頒布的2019 版《慢性乙型肝炎防治指南》[1]。
高敏HBV-DNA 采用羅氏COBASAmpliPrep/COBAS TaqMan48 病毒載量系統(tǒng),試劑盒購(gòu)自羅氏診斷公司;乙型肝炎病毒分型和耐藥測(cè)序采用美國(guó)ABI 公司生產(chǎn)的 3500Dx 測(cè)序儀,試劑盒購(gòu)買自廣州立菲達(dá)安公司;血清HBsAg 測(cè)定,采用的是羅氏診斷公司生產(chǎn)的Modular E610 全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,試劑購(gòu)買自羅氏診斷公司;血清ALT 定量測(cè)定采用日本奧林巴斯生產(chǎn)的AU5400 型生化分析儀,試劑購(gòu)自日本和光純藥株式會(huì)社。
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法,嚴(yán)格按說明書進(jìn)行乙肝病毒載量檢測(cè),檢測(cè)靈敏度為20 IU/mL。
從血清標(biāo)本中提取乙肝病毒核酸,對(duì)HBV P區(qū) RT 段序列進(jìn)行擴(kuò)增,得到的產(chǎn)物純化后,利用基因測(cè)序儀進(jìn)行Sanger 測(cè)序。通過對(duì)乙肝病毒的基因型以及核苷類藥物耐藥相關(guān)位點(diǎn)(如:rt184、rt204、rt169、rt180、rt181、rt173、rt236、rt250 等)進(jìn)行基因序列比對(duì)分析,并且參照《2017 年歐洲肝病年會(huì)乙型肝炎病毒感染臨床實(shí)踐指南要點(diǎn)》[5],進(jìn)行不同藥物的耐藥位點(diǎn)檢出情況及分類的結(jié)果判讀。
采用羅氏Modular E610 全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)血清HBeAg、HBsAg 進(jìn)行測(cè)定,檢測(cè)結(jié)果:S/CO≥1.0 為陽(yáng)性。
采用奧林巴斯AU5400 型生化分析儀對(duì)血清ALT 進(jìn)行檢測(cè),正常參考范圍:上限為40 U/L。
檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。資料組間分類計(jì)數(shù)比較,采用χ2檢驗(yàn),P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
707 例持續(xù)低載量慢性乙肝患者中,高敏HBV DNA < 500 IU/mL 446 例,占(63.50%),< 2 000 IU/mL 的慢性乙肝患者共有576 例,占(81.90%);HBeAg 陽(yáng)性262 例(37.05%),基因分型以C 基因型占比最高60.53%(428/707),見表1。
表1 低病毒載量的慢性乙肝患者病毒學(xué)特征和基因型分布Tab.1 Virological characteristics and genotype distribution of chronic hepatitis B patients with low viral load
本研究707 病例中,高 敏HBV DNA <2 000 IU/mL 的慢性乙肝患者共有576 例,其中HBeAg 陽(yáng)性者196 例。在196 例HBeAg 陽(yáng)性且HBV DNA < 2 000 IU/mL 慢性乙肝患者組中,男性為主,占69.89%;ALT > 40 U/L 占28.57%,有73.47%的患者HBV DNA > 20 IU/mL,HBsAg 定量為100~999、1 000~9 999 IU/mL 的患者占比分別為25.51%和51.53%,見表2。
表2 196 例HBeAg 陽(yáng)性且HBV DNA < 2 000 IU/mL 慢性乙肝患者的基本特征Tab.2 Basic characteristics of 196 chronic hepatitis B patients with HBeAg(+)and HBV DNA < 2 000 IU/mL
持續(xù)低載量的慢乙肝患者臨床指標(biāo)比較,HBeAg 陽(yáng)性率、ALT 異常率、耐藥位點(diǎn)和其它位點(diǎn)突變率在不相同HBV DNA 水平之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),在265 例HBV DNA < 20 IU/mL 的慢性乙肝患者中,HBeAg 陰性者占80.38%(213 例),HBeAg 陽(yáng)性占19.62%(52 例)。其中,在265 例HBV DNA < 20 IU/mL 慢性乙肝患者中,ALT > 40 U/L 占18.49%,具體如表3 所示。在53 例HBV DNA 20~99 IU/mL 和128 例HBV DNA 100~499 IU/mL 慢性乙肝患者中,耐藥位點(diǎn)和其它位點(diǎn)突變率較高。
表3 不同HBV DNA 低載量慢性乙肝患者臨床指標(biāo)比較[n(%)]Tab.3 Comparison of clinical indicators in patients with chronic hepatitis B with different HBV DNA load [n(%)]
本研究707 病例中,高敏HBV DNA < 500 IU/mL的慢性乙肝患者共有446 例,占63.08%,將其分為耐藥突變組、無耐藥突變組和其它位點(diǎn)突變組。HBeAg 陽(yáng)性率、ALT 異常率在不相同HBV DNA水平之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05),而在耐藥突變組中ALT 異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表4。
表4 446 例高敏 HBV DNA < 500 IU/mL 患者在不同耐藥突變情況下HBV DNA 水平與HBeAg、ALT 異常率分析[n(%)]Tab.4 Analysis of HBV DNA level and abnormal rate of HBeAg and ALT in 446 patients with highly sensitive HBV DNA <500 IU/mL under different drug-resistant mutations [n(%)]
定量檢測(cè)HBV DNA,能準(zhǔn)確地反映慢性乙肝患者體內(nèi)乙肝病毒的復(fù)制水平,在治療效果監(jiān)測(cè)、制定療程、判斷治療終點(diǎn)等方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值[6]。同時(shí)也可判斷乙肝病毒復(fù)制程度、為進(jìn)行HBV 基因分型及耐藥檢測(cè)提供相關(guān)信息[7-8]。近年來,國(guó)內(nèi)外的乙肝防治指南都推薦使用高敏檢測(cè)方法檢測(cè)HBV DNA,以幫助判斷治療終點(diǎn)。比如我國(guó)最新的《慢性乙型肝炎防治指南》(2019 版)[1]明確的指出:CHB 的治療的目標(biāo)是長(zhǎng)期地、最大限度地抑制 HBV 復(fù)制,如果部分患者已經(jīng)具備了臨床治愈的適合條件,應(yīng)力求其達(dá)到停止治療以后仍然保持HBsAg 為陰性、檢測(cè)不到HBV DNA、肝臟相關(guān)生物化學(xué)指標(biāo)正常的治療目標(biāo)。而目前我們國(guó)內(nèi)常規(guī)HBV DNA 熒光定量檢測(cè)下限普遍 > 100 IU/mL,陰性范圍寬、靈敏度低[9],難以完全滿足臨床治療的需求。本研究中707 例持續(xù)低載量慢性乙肝患者中,高敏HBV DNA < 500 IU/mL 446 例,占(63.50%),如果檢測(cè)方法不夠敏感,這類患者很可能被臨床忽視,不能被及時(shí)發(fā)現(xiàn)。因此,高靈敏度和特異性的HBV DNA 定量檢測(cè)方法有助于臨床判斷患者病情發(fā)展和治療效果,更精準(zhǔn)地判斷停藥時(shí)機(jī)。
本研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)低載量慢性乙肝患者中,男性患者占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),比例為63.50%(499/707),基因分型以C 基因型占比最高60.53%(428/707),基因型分布與本地區(qū)相關(guān)研究報(bào)告[10]結(jié)果基本一致,而與有關(guān)研究顯示:我國(guó)南方以B 型為主,北方以C 型為主,D 型主要見于部分少數(shù)民族地區(qū)和西藏[11]的情況則有所不同,這說明HBV 基因型分布一定程度上受到地域分布差異的影響。同時(shí),有很多研究[12-15]表明,相對(duì)乙肝其它型別患者,HBV C 型比患者更容易發(fā)生肝硬化、肝癌,所占的比例最高。在患者中,云南省及昆明地區(qū)的乙肝感染實(shí)際情況是以C 型感染為主,這就提示在臨床治療過程中,需要加強(qiáng)制定針對(duì)性臨床治療預(yù)防和控制措施。
部分可能存在“低病毒血癥”的慢乙肝患者,因?yàn)轶w內(nèi)的HBV DNA 持續(xù)或者間歇性地大于檢測(cè)下限,但又小于2000 IU/mL,就可能導(dǎo)致應(yīng)答不佳[1]。在707 例持續(xù)低載量慢性乙肝患者中,HBV DNA < 2 000 IU/mL 的患者共有576 例,占(81.90%),出現(xiàn)了低病毒血癥。我國(guó)專家共識(shí)[16]一致認(rèn)為進(jìn)行長(zhǎng)期的抗乙肝病毒治療以后,患者的 HBV DNA 應(yīng) < 20 IU/mL,而據(jù)有關(guān)研究表明[17-19],有20%~37.9%使用如替諾福韋、恩替卡韋等一線抗乙肝病毒核苷類藥物治療的患者,仍然長(zhǎng)期處于低病毒血癥狀態(tài)。這種狀態(tài)的持續(xù),可能會(huì)進(jìn)一步引起患者發(fā)生肝纖維化、肝硬化等病變。因此本研究采用檢測(cè)下限是20 IU/mL 的高敏HBV DNA 載量檢測(cè)方法,可以避免漏掉一部分病毒載量20~1 000 IU/mL 的患者,使其能被盡早發(fā)現(xiàn),盡早治療。
目前的研究[20-21]普遍認(rèn)為HBsAg 陽(yáng)性是HBV 感染的血清標(biāo)志,HBsAg 定量檢測(cè)在慢乙肝患者診斷、治療、預(yù)后等方面的臨床意義是臨床研究的熱點(diǎn)。本研究196 例HBeAg 為陽(yáng)性且HBV DNA < 2 000 IU/mL 患者組中有52 例患者HBV DNA < 20 IU/mL,但其 HBsAg 均為陽(yáng)性,HBsAg 定量為10~99、100~999、1 000~9 999 IU/mL 的患者占比分別為7.65%、25.51%和51.53%,提示在極低病毒載量水平的慢乙肝患者中,HBsAg 的實(shí)際表達(dá)和清除速率并不能同步反映乙肝病毒載量的變化情況。造成這種情況的原因,可能與相關(guān)研究[22]發(fā)現(xiàn)的結(jié)論是相同的,即處于低復(fù)制期的很多患者 HBV DNA 載量明顯降低,但只有部分患者HBsAg 定量有緩慢降低的趨勢(shì),可實(shí)現(xiàn)HBsAg 清除。另外,盧建華等研究[23]指出,當(dāng) HBsAg 在 0~5 000 IU/mL 時(shí)是治療乙肝的關(guān)鍵時(shí)期,應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)測(cè)此范圍患者的病情變化,根據(jù)變化及時(shí)采取措施進(jìn)行控制。本研究結(jié)果也提示在臨床治療過程中,HBsAg 可作為乙肝低病毒載量患者病情轉(zhuǎn)歸的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。
通過對(duì)本研究中707 例持續(xù)低載量的的慢性乙肝患者的臨床指標(biāo)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),HBeAg 陽(yáng)性率、ALT 異常率、耐藥位點(diǎn)和其它位點(diǎn)突變率在各個(gè)不相同乙肝病毒載量水平組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。高敏HBV DNA < 2 000 IU/mL 的患者共有576 例,其中HBeAg 陽(yáng)性者196 例(34.03%)。在196 例HBeAg 為陽(yáng)性且HBV DNA < 2 000 IU/mL 患者組中,男性為主,占69.89%,年齡多集中在30~60 歲,這種情況與慢性乙肝自然史的發(fā)展趨勢(shì)相符合。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,在HBV DNA < 2 000 IU/mL 且 HBeAg 為陽(yáng)性的患者,其乙肝病毒載量相對(duì)較高,有73.47%的患者HBV DNA > 20 IU/mL,顯示出HBeAg 與HBV DNA 之間息息相關(guān),恰好符合慢乙肝病程從免疫耐受期演變到免疫清除期的發(fā)展規(guī)律。ALT 主要存在于人體肝細(xì)胞內(nèi),可準(zhǔn)確反映肝功能損傷程度,是一種能夠?qū)Φ筒《据d量慢性乙肝患者肝功能損傷程度進(jìn)行準(zhǔn)確反映的最靈敏度指標(biāo)之一[24],但經(jīng)本研究結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),在HBV DNA < 500 IU/mL 且發(fā)生耐藥突變的患者組別中,ALT 異常率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05),提示ALT 的異常不能完全準(zhǔn)確反映病毒低水平復(fù)制狀態(tài)下的患者,其體內(nèi)病毒復(fù)制的情況。在HBV DNA 20~99 IU/mL 和HBV DNA 100~499 IU/mL 患者中,耐藥位點(diǎn)和其它位點(diǎn)突變率較高,與相關(guān)文獻(xiàn)[25]研究報(bào)導(dǎo)相一致,耐藥突變的發(fā)生會(huì)引起病毒載量下降,因此臨床在治療過程中僅僅依據(jù)患者血清乙肝病毒載量的結(jié)果,是難以判斷病毒學(xué)突破的,并且如果患者體內(nèi)病毒載量呈現(xiàn)反復(fù)的低水平波動(dòng),就將難以預(yù)測(cè)其肝損情況和預(yù)后效果,因此臨床需加強(qiáng)關(guān)注此類患者其它相關(guān)肝病的臨床指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)部分患者即使體內(nèi)病毒含量極低,也存在一定比例的病毒耐藥位點(diǎn)突變。所以,持續(xù)低病毒血癥是否就會(huì)誘導(dǎo)乙肝病毒耐藥發(fā)生呢?乙肝病毒基因型、治療藥物種類等因素與持續(xù)低病毒血癥是又有怎樣的確切關(guān)系,還有待筆者將來進(jìn)一步研究。
綜上所述,對(duì)持續(xù)低水平病毒血癥的慢性乙型肝炎患者,選擇高敏的PCR 技術(shù)定期監(jiān)測(cè)持續(xù)低水平病毒血癥患者的乙肝病毒HBV DNA,結(jié)合HBeAg、HBsAg、ALT 等臨床指標(biāo)的定量監(jiān)測(cè),有助于延緩患者疾病的進(jìn)展過程,有效降低患者肝臟的病理性損傷,從而獲得更佳的治療效果。