王 靜 ，米弘瑛 ，張 熠 ，李 麗 ，余建華 ，劉麗巧 ，劉慶瑜 ，王立偉

（1）大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671003;2）云南省第一人民醫(yī)院兒科，云南 昆明 650032;3）昆明理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650032;4）云南省第一人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，云南 昆明 650032;5）昆明理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650032）

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒常見(jiàn)的消化道疾病，臨床上以腹脹、嘔吐、便血為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重者可發(fā)生消化道穿孔、彌漫性腹膜炎、休克、多器官功能衰竭[1-3]。NEC 發(fā)病的基本機(jī)制是腸道炎癥反應(yīng)，近年來(lái)關(guān)于NEC 發(fā)病機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)，但至今尚未闡述清楚。有研究者發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡（Pyroptosis）的關(guān)鍵分子在NEC 中會(huì)明顯升高，如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-18、天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-1、消皮素 D（gasdermin D，GSDMD）等，從而證實(shí)了細(xì)胞焦亡參與NEC 的發(fā)病[4-6]。但是這些關(guān)鍵分子蛋白是否會(huì)在早期NEC 中明顯升高，值得進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。

1 材料與方法

1.1 NEC 動(dòng)物模型建立及分組

以新出生的子鼠為研究對(duì)象，買(mǎi)懷孕14 d 的SD 孕鼠，購(gòu)自昆明理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，孕鼠在動(dòng)物房適應(yīng)7 d 左右后待其自然生產(chǎn)。將新出生的子鼠按照完全隨機(jī)分組方法，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。對(duì)照組子鼠15 只，與母鼠同籠，由母鼠以鼠乳喂養(yǎng)，待其自然生長(zhǎng)，不做任何處理。最終選取12 只正常子鼠納入實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

實(shí)驗(yàn)組子鼠20 只，運(yùn)用缺氧、喂養(yǎng)不當(dāng)、寒冷刺激等處理誘導(dǎo)子鼠發(fā)病，將子鼠放置在缺氧培育箱中，缺氧箱內(nèi)氣體是5%氧氣混合95%氮?dú)?，每天缺氧處? 次，每次10 min，連續(xù)處理3 d，間隔期將子鼠放置4 ℃的冰箱進(jìn)行寒冷刺激，同樣是每天進(jìn)行3 次，每次10 min，連續(xù)處理3 d，誘導(dǎo)過(guò)程中以鼠乳代用品人工喂養(yǎng)[7-8]。排除死亡子鼠，將實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)活動(dòng)能力減少、反應(yīng)變差、攝食減少、腹脹、胃潴留的子鼠定義為早期NEC 模型子鼠，共計(jì)12 只，并納入實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

本次研究早期NEC 小鼠模型的定義參考新生兒早期NEC 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9-10]，前期通過(guò)對(duì)臨床上早期NEC 患兒糞便隱血陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)，研究結(jié)果提示早期NEC 出現(xiàn)糞便隱血的陽(yáng)性率不高[11]，故建模中無(wú)論子鼠糞便有無(wú)肉眼血絲均視為建模成功，上述子鼠的癥狀與臨床中新生兒早期NEC 癥狀基本一致。

1.3 蛋白濃度的測(cè)定

將所有建模成功的子鼠處以安樂(lè)死，立即抽取處以安樂(lè)死子鼠的血液于收集管中，小心分離出血清，置于-80 ℃冰箱中保存。Elisa 試劑盒由睿信生物公司提供，分別是IL-18、Gasdermin D、Caspase-1 等3 個(gè)試劑盒，按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)步驟測(cè)定血清中目標(biāo)蛋白分子的吸光度，通過(guò)樣本的吸光度（OD 值），利用方程計(jì)算血清中蛋白分子的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本次研究采用隨機(jī)對(duì)照的研究方法，用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，由于蛋白分子濃度總體分布不明，需進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，經(jīng)S-W 檢驗(yàn)以及直方圖結(jié)果顯示，各組數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，因此數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，故運(yùn)用秩和檢驗(yàn)對(duì)上述蛋白分子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組子鼠腸道形態(tài)變化

2 組子鼠腸道組織肉眼觀察所示：實(shí)驗(yàn)組子鼠的腸道在開(kāi)腹時(shí)呈現(xiàn)出腸管 明顯積氣增粗，取出后如圖1A 所示部分腸壁顏色變暗，出現(xiàn)缺血樣改變，腸腔內(nèi)有較多血性液體積聚，腸曲形態(tài)自然，腸壁光滑，并未出現(xiàn)明顯壞死及串珠樣改變；對(duì)照組子鼠的腸道在開(kāi)腹時(shí)并無(wú)積氣表現(xiàn)，取出后如圖1B 所示腸管呈淡黃色，腸腔內(nèi)無(wú)血性液體積聚，腸曲形態(tài)自然，腸壁光滑。

圖1 2 組子鼠腸道組織肉眼觀察Fig.1 Macroscopic observation on intestinal tissue of two groups of rats

2.2 血清中Gasdermin D 的濃度分析

用Gasdermin D Elisa 試劑盒檢測(cè)2 組子鼠血清中Gasdermin D 蛋白分子的濃度，實(shí)驗(yàn)組Gasdermin D 濃度的中位數(shù)為1.200 0（1.060 0，1.522 5），對(duì)照組中位數(shù)為1.010 0（0.762 5，1.092 5），運(yùn)用秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析方法，結(jié)果提示P為0.017，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組子鼠血清中Gasdermin D 的濃度高于對(duì)照組，見(jiàn)表1，圖2。

表1 2 組子鼠血清中Gasdermin D 濃度差異比較[M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of serum Gasdermin D concentration difference between two groups of rats [M（P25，P75）]

圖2 2 組血清中Gasdermin D 的濃度分布（ng/mL）Fig.2 Concentration distribution of Gasdermin D in serum of two groups（ng/mL）

2.3 血清中Caspase-1 的濃度分析

2 組子鼠血清中Caspase-1 蛋白分子的濃度，實(shí)驗(yàn)組Caspase-1 濃度的中位數(shù)為4.090 0（3.117 5，4.917 5），對(duì)照組中位數(shù)為2.255 0（1.992 5，2.900 0），運(yùn)用秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析方法，結(jié)果提示P＜ 0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組子鼠血清中Caspase-1 的濃度高于對(duì)照組，見(jiàn)表2，圖3。

圖3 2 組血清中Caspase-1 的濃度分布（ng/mL）Fig.3 Concentration distribution of Caspase-1 in serum of two groups（ng/mL）

表2 2 組子鼠血清中Caspase-1 濃度差異比較[M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of Caspase-1 concentration difference between two groups of rats [M（P25，P75）]

2.4 血清中IL-18 的濃度分析

與上述Gasdermin D 及Caspase-1 統(tǒng)計(jì)結(jié)果不同，用試劑盒檢測(cè)兩組子鼠血清中IL-18 蛋白分子的濃度，實(shí)驗(yàn)組IL-18 濃度的中位數(shù)為 9.305 0（8.335 0，10.200 0），對(duì)照組中位數(shù)為8.910 0（8.147 5，10.042 5），秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果提示P為0.755，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即實(shí)驗(yàn)組子鼠血清中IL-18 的濃度與對(duì)照組無(wú)明顯差異，見(jiàn)表3，圖4。

圖4 2 組血清中IL-18 的濃度分布（ng/mL）Fig.4 Concentration distribution of IL-18 in serum of two groups（ng/mL）

表3 2 組子鼠血清中IL-18 濃度差異比較[M（P25，P75）]Tab.3 Comparison of IL-18 concentration difference between two groups of rats [M（P25，P75）]

3 討論

NEC 是新生兒最嚴(yán)重的消化道疾病，實(shí)質(zhì)是腸道炎癥反應(yīng)，與腸道菌群失調(diào)、喂養(yǎng)不耐受、腸道粘膜屏障受損、免疫力低下、感染、缺血缺氧等因素密切相關(guān)[12-15]，主要累及遠(yuǎn)端小腸和近端結(jié)腸[16]，中性粒細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)導(dǎo)致穿孔、腹膜炎、全身性膿毒癥和多器官衰竭等危及患兒生命，發(fā)病機(jī)制過(guò)于復(fù)雜，目前認(rèn)為是免疫系統(tǒng)的過(guò)度炎癥反應(yīng)，引起劇烈的炎癥風(fēng)暴，導(dǎo)致腸道通透性增加、細(xì)菌移位和炎癥，但是具體機(jī)制尚不明確[17-18]。

近年來(lái)，NEC 的炎癥機(jī)制已然成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，有研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡這一特殊的細(xì)胞死亡方式，參與NEC 的發(fā)病。細(xì)胞焦亡是一種細(xì)胞程序性死亡的方式，而Gasdermin D 是炎癥細(xì)胞死亡的核心蛋白分子，Gasdermin D 發(fā)揮有賴于被活化的Caspase-1、Caspase-11 及人類(lèi)同源的Caspase-4/5 等切割成有活性的N-端結(jié)構(gòu)域和無(wú)活性的C-端結(jié)構(gòu)域，有活性的N-端結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜上特定的磷脂分子結(jié)合，介導(dǎo)非離子選擇性孔道的形成，將細(xì)胞內(nèi)IL-18 等炎癥介質(zhì)釋放至細(xì)胞外[19-23]。因此，當(dāng)機(jī)體發(fā)生細(xì)胞焦亡時(shí)，血清中IL-18、Gasdermin D、Caspase-1 等蛋白分子的濃度會(huì)出現(xiàn)升高。

既往研究者通過(guò)建立動(dòng)物模型探討NEC 的發(fā)病機(jī)制[24]，致力于發(fā)現(xiàn)對(duì)NEC 診斷具有較高敏感度及特異性的生物蛋白分子[25-26]，在研究過(guò)程中證實(shí)細(xì)胞焦亡參與NEC 的發(fā)病，但是具體的信號(hào)通路仍在進(jìn)一步研究，同時(shí)提出Gasdermin D、Caspase-1 的發(fā)現(xiàn)有望為NEC 的抗炎治療提供新的方向[27-28]。本次研究著力于早期NEC 的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)建立與早期臨床癥狀相符的動(dòng)物模型，探討IL-18、Gasdermin D、Caspase-1 等細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵分子蛋白是否會(huì)在早期NEC 中明顯升高，并且希望通過(guò)本次研究，發(fā)現(xiàn)適用于NEC 早期診斷的特異性分子蛋白，從而達(dá)到提高早期診斷率、及時(shí)進(jìn)行干預(yù)的目的[29-30]。

由于早期NEC 患兒腸道炎癥較輕，診斷依據(jù)主要為臨床表現(xiàn)及體征，而實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)檢查均無(wú)明顯特異性，在治療上通常采取內(nèi)科治療方式，因此本次研究基于與臨床相符原則，參照早期NEC 的臨床癥狀建立早期NEC 動(dòng)物模型，以癥狀為主要建模成功標(biāo)準(zhǔn)，并未對(duì)腸道組織進(jìn)行組織病理學(xué)形態(tài)分析。在建模過(guò)程中，新生子鼠的活動(dòng)能力、喂養(yǎng)情況、一般反應(yīng)均變差，并出現(xiàn)腹脹癥狀，在下一次喂養(yǎng)之前進(jìn)行胃液回抽可見(jiàn)胃液殘留增多，將處以安樂(lè)死的子鼠剖開(kāi)腹部可見(jiàn)腸管明顯充氣擴(kuò)張，臨床上早期NEC 患兒的影像學(xué)征象主要以腸管積氣擴(kuò)張為主，因此本次研究中的動(dòng)物模型與早期新生兒NEC 臨床表現(xiàn)基本一致，并且從圖1 中A 圖所示，肉眼觀實(shí)驗(yàn)組子鼠腸腔內(nèi)可見(jiàn)血性液體增多，部分腸壁呈現(xiàn)缺血樣改變，也證實(shí)了實(shí)驗(yàn)組子鼠腸道已經(jīng)出現(xiàn)炎癥性損傷。

本次研究發(fā)現(xiàn)，Gasdermin D、Caspase-1 作為細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵蛋白分子，在實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物模型血清中的濃度出現(xiàn)升高，推斷這兩種蛋白分子在早期NEC 中就會(huì)出現(xiàn)升高，因此細(xì)胞焦亡在早期就參與NEC 的發(fā)病。Gasdermin D、Caspase-1 可能通過(guò)介導(dǎo)炎癥分子的逐級(jí)激活，參與炎癥的發(fā)生，導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞炎癥性損傷，并且可能成為NEC 靶向治療的特異性蛋白分子[31-32]，通過(guò)抑制這兩種蛋白分子活性，從而達(dá)到抑制炎癥逐級(jí)激活，減輕NEC 腸道炎癥反應(yīng)。通常IL-18 作為Gasdermin D 的下游炎癥分子，理論上實(shí)驗(yàn)組血清中的濃度應(yīng)該高于對(duì)照組，而本次研究中IL-18 在兩組血清中的濃度無(wú)明顯差異，由于各炎癥分子之間相互激活途徑比較復(fù)雜，因此有待進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

綜上所述，本研究通過(guò)建立早期NEC 的動(dòng)物模型，檢測(cè)血清中Gasdermin D、Caspase-1 等在早期NEC 中明顯升高，從而證實(shí)了細(xì)胞焦亡參與早期NEC 的發(fā)病，但是具體的參與機(jī)制有待以后各位學(xué)者繼續(xù)研究探索，并且Gasdermin D 及Caspase-1 在新生兒血清中正常的參考值范圍值得進(jìn)一步明確，為臨床上早期NEC 的診斷及治療提供新的方向。