高志遠(yuǎn)，陳興杰，薛錫佳，鞏子路，鹿靜靜，潘天全，關(guān)玉權(quán)，程 偉

(安徽金種子酒業(yè)股份有限公司，安徽阜陽 236023)

中國白酒以大曲作為釀造的糖化、發(fā)酵、酒化和生香劑(如醬香、濃香、芝麻香、大曲清香、兼香等香型白酒)，大曲品質(zhì)對(duì)白酒的產(chǎn)酒率及品質(zhì)有著十分重要的影響[1-2]。當(dāng)前，對(duì)大曲微生物種群結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行了較多的分析，發(fā)掘出傳統(tǒng)技術(shù)不能培養(yǎng)的微生物菌群，并通過克隆測序等技術(shù)把優(yōu)勢菌群鑒定到種。大曲微生物結(jié)構(gòu)對(duì)大曲風(fēng)味及其原酒的風(fēng)格和品質(zhì)具有重要影響，研究大曲微生物結(jié)構(gòu)及揮發(fā)性組分，對(duì)明確白酒風(fēng)格特點(diǎn)具有重要意義。施思等[3]利用高通量測序?qū)庀阈痛笄A藏階段的真菌多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明畢赤酵母屬、根霉屬和恒梗霉屬為貯藏階段的最終優(yōu)勢菌群；梁辰等[4]利用MiSeq高通量測序剖析大曲成熟過程中原核微生物群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明，大曲貯存過程中原核微生物的代謝活動(dòng)對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要的影響。由于大曲中含有較多的色素與油脂，頂空固相微萃?。℉S-SPME）作為大曲揮發(fā)性組分分析的前處理方法，可以有效減少底物及液態(tài)基質(zhì)中干擾物質(zhì)的影響。HS-SPME 與傳統(tǒng)萃取法相比具有樣品用量少、檢測時(shí)間短等特點(diǎn)，可避免樣品熱解所導(dǎo)致的檢測誤差。陳勇等[5]采用HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用技術(shù)測定大曲中的揮發(fā)性組分，考察了萃取頭、萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品用量以及萃取方式等的影響，提高了該技術(shù)對(duì)大曲揮發(fā)性組分的萃取效率。

當(dāng)前，關(guān)于江淮地區(qū)濃香型大曲微生物群落和揮發(fā)性組分的研究逐漸增多，但對(duì)江淮地區(qū)濃香型大曲不同部位的微生物群落及其揮發(fā)性組分的對(duì)比研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以金種子濃香型大曲為樣品，以曲皮和曲心為研究對(duì)象，采用MiSeq 高通量測序技術(shù)進(jìn)行微生物群落結(jié)果分析，運(yùn)用HSSPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行揮發(fā)性組分分析。本研究可為濃香型大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)及其揮發(fā)性組分的關(guān)聯(lián)性評(píng)價(jià)、大曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其完善等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)曲樣：新出房的優(yōu)質(zhì)濃香型大曲（培曲時(shí)間為28 d，培曲月份為春季的3—4 月），由安徽金種子酒業(yè)股份有限公司生態(tài)釀酒基地制曲車間提供。

試劑及耗材：2%濃度的瓊脂糖凝膠，膠回收試劑盒，由qiagen公司提供。

儀器設(shè)備：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，7890A+5975C，EI 源），安捷倫科技有限公司；57330-U 手動(dòng)SPME 進(jìn)樣器，50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司；TGL-20M高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；GeneAmp@9700 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCPO）儀，美國ABI 公司；QuantiFluor 型-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)，美國Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 取樣方法

從曲樣的不同區(qū)域（表層、內(nèi)部）取樣，作為曲皮和曲心樣品（以下簡稱為FYS 和FYI）。分別采集2 份樣品，1 份在無菌環(huán)境下粉碎后保存于無菌袋中，置于-80 ℃?zhèn)湮⑸锶郝浞治?；?份粉碎后保存于普通樣品袋中，置于-4 ℃?zhèn)銰C-MS分析。

1.2.2 樣品的微生物群落分析

大曲微生物總DNA的提?。翰捎肅TAB或SDS方法對(duì)樣品的基因組DNA 進(jìn)行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量的樣本DNA置于離心管中，用無菌水稀釋至1 ng/μL。

PCR 擴(kuò)增定量：以稀釋后的基因組DNA 為模板，使用帶Barcode 的特異引物(Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer: New England Biolabs)和高效高保真酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。引物對(duì)應(yīng)區(qū)域：16S V4區(qū)引物（515F 和806R）鑒定細(xì)菌多樣性；ITS1 區(qū)引物（ITS5-1737F和ITS2-2043R）鑒定真菌多樣性。

PCR 產(chǎn)物的混樣和純化：使用2%濃度的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳，對(duì)檢測合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化；采用酶標(biāo)定量，根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測，對(duì)目的條帶使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

文庫構(gòu)建和上機(jī)測試：使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 和Q-PCR 定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000 進(jìn)行上機(jī)測序。建庫與測序等工作在蘇州帕諾米克生物科技有限公司完成。

1.2.3 樣品的HS-SPME-GC-MS揮發(fā)性組分分析

HS-SPME 方法：參考Ding 等[6]的方法，稱取1.00 g 大曲樣品放入頂空瓶中，再加入20 μL 2-辛醇甲醇溶液（內(nèi)標(biāo)終濃度為40.64 μg/g），蓋上瓶蓋；取50/30 μm DVB/CAR/ PDMS 萃取頭，在磁力攪拌器上插入加有20 μL 2-辛醇甲醇溶液和1.00 g大曲的頂空瓶，萃取溫度60 ℃，平衡10 min 后頂空吸附35 min，再插入溫度為250 ℃的氣質(zhì)聯(lián)用儀解吸5 min后進(jìn)行檢測。

氣相色譜與質(zhì)譜條件：氦氣作為載氣，流速控制為1 mL/min；升溫程序：起始溫度40 ℃，維持3 min，以5 ℃/min 升至80 ℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃，維持8 min；氣化室溫度為250 ℃；不分流。質(zhì)譜條件：選擇電子轟擊電離離子源（EI），電子能為70 eV，離子源溫度為230 ℃，質(zhì)量范圍控制在40～400 u。

GC-MS 數(shù)據(jù)分析：各揮發(fā)性組分經(jīng)NIST 數(shù)據(jù)庫譜庫檢索，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)解析譜圖，選擇匹配度＞800 的鑒定結(jié)果以確定揮發(fā)性組分的種類，進(jìn)行定性分析；以2-辛醇甲醇作為內(nèi)標(biāo)，將各揮發(fā)性組分的峰面積除以所有測得揮發(fā)性組分峰面積的總和，與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度作比，進(jìn)行半定量分析。C(μg/kg)=Ac/Ais·Cis(μg/kg)；C：待測揮發(fā)性組分的質(zhì)量濃度；Cis：內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度；Ac：待測揮發(fā)性組分的峰面積；Ais：內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲微生物多樣性指數(shù)分析

應(yīng)用Illumian Mi Seq 高通量測序技術(shù)對(duì)金種子濃香型大曲的曲皮與曲心中細(xì)菌和真菌的多樣性進(jìn)行分析，其16S rRNA 與ITS 測序結(jié)果及多樣性指數(shù)如表1 所示。Observed species 指數(shù)和Chao1指數(shù)能估算樣品中含有的物種數(shù)目（即OTU 數(shù)目），均能反映樣品的物種豐度。Shannon指數(shù)可以反應(yīng)樣品中物種的分類總數(shù)及其占比，Simpson 指數(shù)用來表征樣品中群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度，均能反映樣品中物種的豐富度、均勻度和物種多樣性[7]。

由表1 的測序結(jié)果及多樣性指數(shù)可知，F(xiàn)YS 和FYI 樣品中分別產(chǎn)生75510 和82834 條真菌序列，根據(jù)97 %相似性歸類分別得到253 個(gè)和240 個(gè)OTU分類；FYS樣品的Observed Species 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 和Chao 1 指數(shù)分別為253、2.389、0.594 和266.684，表明樣品真菌群落的豐富度和多樣性較高。由表1 可知，F(xiàn)YS 和FYI 樣品中分別產(chǎn)生78226 條和78880 條細(xì)菌序列，根據(jù)97%相似性歸類分別得到340 個(gè)和342 個(gè)OTU 分類。綜上可知，不同樣品的Observed Species指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 和Chao 1 指數(shù)表明樣品細(xì)菌群落的豐富度和多樣性均高于真菌。

表1 金種子濃香型大曲真核微生物的測序結(jié)果及多樣性指數(shù)

由圖1（a）可知，F(xiàn)YS 和FYI 的真菌OTU 分別為253 個(gè)和240 個(gè)，共有OTU 為141 個(gè)；共有OTU占FYI 總真菌OTU 的58.75%，共有OTU 占FYS 總真菌OTU 的55.73 %，綜上可知，F(xiàn)YS 的真菌多樣性高于FYI。由1（b）可知，F(xiàn)YS 和FYI 的細(xì)菌OTU分別為340 個(gè)和342 個(gè)，共有OTU 為221 個(gè)；共有OTU 占FYI 總細(xì)菌OTU 的64.62 %，共有OTU 占FYS 總細(xì)菌OTU 的65.00%，綜上可知，F(xiàn)YI 的細(xì)菌多樣性高于FYS。

圖1 基于屬水平金種子濃香型大曲的曲皮和曲心中OTU水平Venn圖

2.2 基于屬水平的金種子大曲微生物分布情況分析

如圖2（a）所示，F(xiàn)YS 中有2 個(gè)真菌屬的相對(duì)豐度大于10%，分別為Rhizopus（根霉菌屬，62.77%）和Saccharomycopsis（扣囊復(fù)膜孢酵母屬，17.10%），Rhizopus屬于優(yōu)勢真菌菌屬；FYS 中相對(duì)豐度大于1.00 %的菌屬有Blumeria（布氏白粉菌屬，9.12 %）、Wickerhamomyces（異常威克漢姆酵母，1.09 %）、Aspergillus（曲霉屬，1.04 %）和Eurotium（冠突散囊菌菌屬，1.01%）。FYI中有2個(gè)真菌屬的相對(duì)豐度大于10%，分別為Thermoascus（嗜熱子囊菌屬，44.89 %）和Thermomyces（嗜熱菌屬，44.61%）；FYI 中相對(duì)豐度大于1.00%的菌屬有Eurotium（冠突散囊菌菌屬，1.59%）、Rhizopus（根霉菌屬，1.23 %）、Rhizomucor（根毛霉菌屬，1.41 %）和Wickerhamomyces（異常威克漢姆酵母，1.36%）。

圖2 基于屬水平的金種子濃香型大曲的微生物相對(duì)豐度柱狀圖

金種子濃香型大曲屬于中高溫大曲，其培養(yǎng)的頂火溫度通常不高于60 ℃，較適宜于大部分真核微生物的生；因此，F(xiàn)YS 中Rhizopus占絕對(duì)優(yōu)勢。Thermomyces是一種嗜熱的絲狀真菌，其最適生長溫度在50 ℃左右，因此，F(xiàn)YI 中Thermomyces占絕對(duì)優(yōu)勢。SINGH S 等[8]的研究表明，Thermomyces可高效表達(dá)半纖維素酶，將釀酒原料細(xì)胞壁成分的半纖維素水解成寡糖，為酵母、細(xì)菌等釀酒微生物提供能量來源；李靜心等[9]的研究表明酵母菌是構(gòu)成中高溫大曲的主要真菌，中高溫大曲中霉菌含量僅有1/4 左右，該研究結(jié)論與金種子濃香型大曲的真菌構(gòu)成相似。

如圖2（b）所示，F(xiàn)YS 中有6 個(gè)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度大于1.00 %，分別為Weissella（魏斯氏菌屬，31.84%）、Staphylococcus（葡萄球菌屬，6.23%）、Li-mosilactobacillus（乳桿菌屬，2.78 %）、Kroppenstedtia（克羅彭斯泰蒂亞，1.64 %）、Pantoea（泛菌屬，1.50 %）、Saccharopolyspora（糖多孢菌，1.38 %），Weissella屬于優(yōu)勢細(xì)菌菌屬。FYI 中有6 個(gè)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度大于1.00 %，分別為Pantoea（泛菌屬，40.19 %）、Erwinia（歐文氏菌屬，18.20 %）、Saccharopolyspora（糖多孢菌，7.56%）、Staphylococcus（葡萄球菌屬，3.31 %）、Kroppenstedtia（克羅彭斯泰蒂亞，2.01%）、Weissella（魏斯氏菌屬，1.69%），其中，Pantoea屬于優(yōu)勢細(xì)菌菌屬。

本實(shí)驗(yàn)表明金種子濃香型大曲的曲皮中乳桿菌目（主要為魏斯氏菌屬Weissella、乳桿菌屬Lactobacillus和片球菌屬Pediococcus）為優(yōu)勢細(xì)菌，其豐度大于31.84%，在白酒固態(tài)發(fā)酵過程中，乳酸菌具有維護(hù)與保持釀酒微生態(tài)環(huán)境的作用，乳酸作為乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物是形成乳酸乙酯等香氣成分的物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究表明[10]，大曲發(fā)酵過程中乳桿菌目（主要為魏斯氏菌屬Weissella、乳桿菌屬Lactobacillus和片球菌屬Pediococcus）、毛霉菌目（主要為橫梗霉屬Lichtheimia）和散囊菌目（主要為曲霉屬Aspergillus、Rasamsonia和絲衣霉屬Byssochla-mys）先后成為主要功能微生物類群，它們相繼承擔(dān)了一系列裂解酶和風(fēng)味前體化合物的代謝任務(wù)。雷振河等[11]應(yīng)用高通量測序技術(shù)對(duì)清香型白酒釀造用大曲和酒醅中微生物構(gòu)成進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，大曲中優(yōu)勢真核微生物主要包括曲霉菌屬、嗜熱子囊菌屬、根霉菌屬、嗜熱真菌屬、假絲酵母屬，本實(shí)驗(yàn)金種子濃香型大曲中的根霉菌屬、嗜熱子囊菌屬、扣囊復(fù)膜孢酵母屬等與雷振河等人的研究結(jié)果相似，存在一定的差異性可能是由于制曲環(huán)境、原料及工藝等因素造成的。

2.3 大曲的HS-SPME-GC-MS揮發(fā)性組分分析

目前，大曲的質(zhì)量判斷標(biāo)準(zhǔn)主要包括理化檢測和感官評(píng)價(jià)，感官評(píng)價(jià)主要依據(jù)大曲的外觀、斷面、菌絲以及聞香等方面。聞香是對(duì)大曲揮發(fā)性組分所表現(xiàn)出來的綜合香氣進(jìn)行的感官評(píng)價(jià)，大曲揮發(fā)性組分對(duì)大曲的香氣具有重要作用，同時(shí)大曲揮發(fā)性組分是白酒香氣的主要來源和前體物質(zhì)，因此，研究大曲揮發(fā)性組分對(duì)大曲的質(zhì)量評(píng)價(jià)及原酒的品質(zhì)穩(wěn)定都具有重要意義。陳蒙恩等[12]利用HSSPME-GC-MS 技術(shù)從陶融型大曲中檢測出7 大類45種揮發(fā)性成分，并解析了大曲微生物群落結(jié)構(gòu)及揮發(fā)性物質(zhì)組成。由表2 所示FYS 中揮發(fā)性組分的分析結(jié)果可知，F(xiàn)YS 中共檢出了27 種揮發(fā)性組分，分別為4 種酸類、1 種醛類、9 種酯類、2 種呋喃類、5 種含氮化合物、6 種芳香族化合物。酯類化合物通常具有令人愉悅的水果樣芬芳香氣，在大曲樣品中檢測到多種酯類物質(zhì)，對(duì)白酒特殊風(fēng)味和品格的形成具有重要作用[13]。

表2 HS-SPME-GC-MS分析鑒定FYS中揮發(fā)性組分的分析結(jié)果

由表3 可知，F(xiàn)YS 中共檢出27 種揮發(fā)性組分，分別為2 種酮類、1 種烯烴、2 種酸類、2 種醇類、9 種酯類、2 種呋喃類、4 種含氮化合物、5 種芳香族化合物。對(duì)比表明，F(xiàn)YS 和FYI 中均檢測到9 種酯類，F(xiàn)YI 中的風(fēng)味組分比FYS 多2 種酮類、1 種烯烴，少2 種酸類。在FYI 中檢測到3 種吡嗪類物質(zhì)，其中4-甲基吡嗪的含量達(dá)到1.86 μg/g。吡嗪類化合物通常具有強(qiáng)烈的堅(jiān)果、焙烤、咖啡、焦香等香氣特征，閾值極低，對(duì)酒體風(fēng)味具有正向貢獻(xiàn)，2,5-二甲基-吡嗪具有刺鼻的炒花生香氣和巧克力、奶油香氣，2,6-二甲基吡嗪具有咖啡和炒花生的香氣，4-甲基吡嗪具有特殊的堅(jiān)果香氣，4-甲基吡嗪具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板積聚，保肝、護(hù)肝以及抑制腫瘤的功效[14]。通過加熱發(fā)生的美拉德反應(yīng)是食品制作過程中產(chǎn)生吡嗪類化合物的重要途經(jīng)，某些耐高溫細(xì)菌的生長代謝過程也產(chǎn)生吡嗪類物質(zhì)。濃香型大曲培曲過程中曲心的溫度普遍高于曲皮的溫度，這可能是曲心中生成吡嗪類化合物的重要原因。綜上可知，曲心中檢測到的3 種吡嗪類化合物可作為曲心區(qū)別于曲皮的特殊組分。

表3 HS-SPME-GC-MS分析鑒定曲心揮發(fā)性組分的分析結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)從曲皮與曲心樣品中均檢測到不同類別的醛酮類揮發(fā)性組分，醛酮類物質(zhì)主要通過大曲微生物降解原料中的淀粉以及在糖酵解過程中產(chǎn)生，尤其是在酵母作用下的糖酵解[15]。大曲中的醛酮類物質(zhì)和酯類物質(zhì)是大曲獨(dú)特香氣的重要構(gòu)成組分，并且醛酮類物質(zhì)作為微生物代謝的前體物質(zhì)在發(fā)酵過程中對(duì)白酒特殊香氣的形成具有重要作用。樣品中檢測到不同類別的芳香族化合物是賦予大曲豐富且復(fù)雜香氣的特殊化合物，主要包括具有典型花草香氣的苯甲醇和苯乙醇，具有典型墨水氣味的萘和苯酚，具有適當(dāng)甜味的甲苯和乙基苯，以及具有苦杏仁味的苯甲醛（安息香醛）[16]。

3 討論與結(jié)論

對(duì)白酒釀造過程中制曲與釀酒的微生物多樣性進(jìn)行分析，結(jié)合代謝組學(xué)原理研究白酒風(fēng)味物質(zhì)，以探究釀造工藝的微生物代謝途徑及機(jī)制、剖析其微生態(tài)作用過程、找到相關(guān)功能菌株等，對(duì)提高白酒品質(zhì)、原料利用率和出酒率、特征風(fēng)味成分的得率等具有重要意義。釀酒大曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，需要綜合感官指標(biāo)、微生物指標(biāo)以及理化指標(biāo)等因素，揮發(fā)性風(fēng)味組分作為大曲的重要理化指標(biāo)，可以作為大曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立過程中的重要依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)以金種子濃香型大曲為樣品，以曲皮和曲心為研究對(duì)象，采用高通量測序技術(shù)和HSSPME-GC-MS技術(shù)對(duì)不同樣品進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)及揮發(fā)性風(fēng)味組分特征對(duì)比分析，得到的結(jié)論主要有：(1)曲皮中的優(yōu)勢真菌屬為Rhizopus（根霉菌屬，62.77 %），優(yōu)勢細(xì)菌屬為Weissella（魏斯氏菌屬，31.84 %）；(2)曲心中的優(yōu)勢真菌屬為Thermoascus（嗜熱子囊菌屬，44.90 %）和Thermomyces（嗜熱菌屬，44.61%），優(yōu)勢細(xì)菌屬為Pantoea（泛菌屬，40.19 %）；(3)曲皮和曲心中均定量檢測出27 種揮發(fā)性組分，分別為酸類、醛類、酯類、呋喃類、含氮化合物和芳香族化合物等，在對(duì)應(yīng)樣品中的種類和含量存在差異；(4)曲心中檢測到的3 種吡嗪類化合物可作為曲心區(qū)別于曲皮的特殊組分。本研究可為濃香型大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)及其關(guān)聯(lián)性評(píng)價(jià)、大曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其完善等提供參考。