王家勝，肖鈞文，周海波，程應(yīng)春，楊 倩，邱燕翅，方尚玲，陳茂彬

(1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430068；2.孝感親親生物科技有限公司，湖北孝感 432100)

在中國傳統(tǒng)釀造過程中，酒曲是不可或缺的核心材料，是釀造微生物和功能酶的主要載體，直接決定著釀造酒體的品質(zhì)和風(fēng)格特性[1]。酒曲有著上千年的歷史，經(jīng)過長時間的選擇或自然淘汰，弱勢菌株被淘汰，優(yōu)勢菌株被保留下來。前人的大量研究表明，酒曲中主要有三大類微生物，即酵母菌、霉菌和細(xì)菌。酒曲中含有豐富的霉菌資源，酒藥中起主要作用的微生物是根霉[2-3]。

根霉是米酒曲中最常見的霉菌之一[4]。它不但有較強(qiáng)的糖化作用,能將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖,而且還有一定的酒化作用，能將糖轉(zhuǎn)化為乙醇，還能產(chǎn)蛋白酶、酒化酶和脂肪酶等一系列酶系[5]。甜酒曲中根霉菌株的優(yōu)劣一般從兩個方面進(jìn)行評估[6-10]：菌株的理化指標(biāo)方面，液化力、糖化力是判斷菌株優(yōu)劣的兩項重要衡量標(biāo)準(zhǔn)；發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量方面。

本實(shí)驗(yàn)對市場上公認(rèn)較好的2 個地區(qū)的特色酒曲中的根霉進(jìn)行分離純化以及特性研究，以優(yōu)良菌株Q303 作為對照，篩選出2 株優(yōu)質(zhì)根霉，研究其發(fā)酵性能及發(fā)酵產(chǎn)物。豐富了米酒曲根霉菌庫，提高了出酒率，降低了生產(chǎn)成本，亦可為后期開發(fā)多菌種復(fù)合甜酒曲提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒曲：江西酒曲、貴陽酒曲；糯米：孝感市朱湖農(nóng)場。

馬鈴薯瓊脂固體培養(yǎng)基(PDA):土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000 mL，pH 值自然。固體培養(yǎng)基需加入2%的瓊脂，115 ℃滅菌20 min。

試劑：硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、冰醋酸、醋酸鈉、亞甲基藍(lán)、碘化鉀，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器與設(shè)備：LRH-250 恒溫生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，浙江金壇市富華儀器有限公司；LDZX-50KBS 高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；5977B-7890B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離與純化

在無菌條件下，將貴陽土曲、江西酒曲粉碎，分別稱取10 g 樣品，倒入裝有90 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，35 ℃搖床振蕩20～30 min，用紗布過濾濾液，對其進(jìn)行適當(dāng)稀釋后用涂布平板法涂于PDA固體培養(yǎng)基中。30 ℃下培養(yǎng)36～48 h，檢查菌落情況。菌絲生長較為明顯時，用接種針挖掘一小塊菌絲移植于另一PDA 平板培養(yǎng)基中。從平板培養(yǎng)基中挑選出單菌落轉(zhuǎn)接到PDA 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h 后，進(jìn)一步挑取單菌落轉(zhuǎn)接和鏡檢，多次分離純化根霉。將分離的根霉轉(zhuǎn)入PDA 斜面上培養(yǎng)，長出菌絲后即可放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹11]。

1.2.2 測定霉菌糖化酶活力

糖化酶活力定義：1 g 干曲，40 ℃、pH4.6、1 h 內(nèi)水解可溶性淀粉為葡萄糖的毫克數(shù)(mg/h·g)。

1.2.2.1 米粉曲的制備

米粉曲的制作采用生料制曲。將秈米進(jìn)行粉碎，紫外殺菌20 min 待用。按稱取米粉量的40 %無菌水量，先用無菌水對斜面進(jìn)行孢子洗脫，后倒入米粉中攪拌均勻，壓實(shí)后，保持濕度80 %，溫度32 ℃恒溫培養(yǎng)72～90 h。期間每隔12 h 翻曲一次。培養(yǎng)完成后置于40 ℃烘箱烘干備用。

1.2.2.2 粗酶液的提取

取1g 米粉曲磨碎后加入18 mL 水和2 mL 乙酸-乙酸鈉溶液，40 ℃水浴鍋中浸提1 h，間隔5 min攪拌一次，補(bǔ)水至25 mL后過濾得粗酶液[12]。

1.2.2.3 糖化酶活力的測定

取12.5 mL、2 %的淀粉溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）于60 ℃水浴鍋中預(yù)熱10 min，加入1 mL 粗酶液，在40 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h 后，加入7.5 mL、0.1 mol/L NaOH 中止反應(yīng)，定容至25 mL，即得樣品。取1 mL樣品于試管中，再加入2 mL 3,5-二硝基水楊酸，水2 mL，搖勻，置于沸水浴中加熱5 min，將其移出，冷卻到室溫，然后用蒸餾水定容到25 mL。搖勻，在540 nm波長下對其進(jìn)行比色，并測量吸光度。

計算公式如下：

式中：x——糖化酶活力，mg/h·g；

c——由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖含量，mg/mL；

v——糖化酶原液總體積，mL；

n——酶液稀釋倍數(shù)；

m——干曲質(zhì)量，g；

t——糖化時間，h。

1.2.3 液化酶活力的測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)顏色的配制

在50 mL 試管中加入5 mL 稀碘液，再滴入1～2滴糊精溶液，搖勻。

1.2.3.2 固體曲浸出液的制備

取5 g 酒曲粉(精確至0.0001 g)，用少量磷酸緩沖液充分溶解，于40 ℃水浴鍋中浸取2 h，每隔15 min 攪拌1 次（保證酶液完全浸取出來，并將酒曲自身的淀粉消耗殆盡），將上清液小心傾入容量瓶中，若有剩余殘渣，再加少量磷酸緩沖液充分研磨，最終樣品全部移入100 mL 容量瓶中，用磷酸緩沖液定容至刻度，搖勻。4 層紗布過濾,濾液待用。

吸取25 mL 20.0 g/L 可溶性淀粉溶液和5 mL磷酸緩沖溶液于100 mL 試管中，35 ℃水浴保溫10 min，加入固體曲浸出液2 mL 及10 mL 水，充分搖勻，開始計時。于40 ℃保溫，定時取出1 滴反應(yīng)液加入裝有稀碘液的試管內(nèi)，觀察顏色變化。當(dāng)?shù)庖侯伾c標(biāo)準(zhǔn)顏色一致時即反應(yīng)終點(diǎn)，立即記錄液化時間t(min)[13]。

1.2.3.3 計算

固體曲液化力的定義：在35 ℃，1 g 酒曲1 h 液化可溶性淀粉的質(zhì)量。

式中：x——液化力(可溶性淀粉)，g/g·h；

25.0——可溶性淀粉溶液用量，mL；

0.020——可溶性淀粉溶液濃度，g/mL；

v——加入的固體曲浸出液的體積，mL；

60——1 h換算成的分鐘數(shù)，min；

t——液化時間，min。

1.2.4 GC-MS對根霉菌發(fā)酵產(chǎn)物的對比分析

頂空固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)具有分離高效、定性準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[14-15]，已成為研究香氣成分的有效手段并被廣泛應(yīng)用[16-18]。

根霉菌發(fā)酵液的培養(yǎng)：將前期分離純化好的根霉菌取一環(huán)接入配制好的PDA 固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，待長出孢子后，將3 株根霉菌各取一環(huán)分別接種于PDA 斜面上，30 ℃條件下培養(yǎng)3 d。根霉長出明顯的菌絲之后，取1～2 環(huán)孢子于10 mL 的無菌生理鹽水中，采用血球計數(shù)板計數(shù)的方法將其稀釋成108cfu/g。取1 mL 孢子懸液接種于100 mL PDA 液體培養(yǎng)基中（pH 值自然），在30 ℃、138 r/min下培養(yǎng)5 d，即得根霉發(fā)酵液。

1.2.4.1 樣品處理方法

準(zhǔn)確移取發(fā)酵液清液6 mL 于30 mL 頂空瓶中，準(zhǔn)確稱取3 g NaCl，加入攪拌子，將頂空瓶密封好，于60 ℃的恒溫磁力攪拌器上平衡10 min，轉(zhuǎn)速為300 r/min；將裝有萃取纖維的進(jìn)樣手柄插入頂空瓶，推出萃取纖維（纖維與液面保持1 cm），在同樣溫度、轉(zhuǎn)速條件下吸附40 min。萃取完成后，取出萃取纖維插入進(jìn)樣口解吸3 min，進(jìn)樣口溫度為260 ℃，然后用GC-MS分析[19]。

1.2.4.2 儀器處理方法

氣相色譜條件：CP-WAX57CB 色譜柱（50 m×0.25 mm×0.20 μm）；載氣為高純氦氣（He），恒定流速為0.7 mL/min，采用不分流模式；色譜柱初始溫度45 ℃保持1.5 min，以6 ℃/min 升至85 ℃不保持，再以4 ℃/min升至225 ℃保持15 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，四極桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃；電子能量70 eV，全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍30～550 aum。

1.2.5 根霉曲試飯發(fā)酵特性的研究

酒釀樣品的制備：將用分離的2 株根霉制作而成的根霉米曲按1.0%的比例接種到煮熟的糯米飯中，34 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵。發(fā)酵24 h、32 h、40 h、48 h、60 h 分別取樣，測定所得酒樣的糖化酶活力、液化酶活力、總糖以及總酸的含量。

總糖的測定方法：根據(jù)黃酒的國家標(biāo)準(zhǔn)，采用廉愛農(nóng)法測定總糖的含量[20]，以每1000 mL 中糖的質(zhì)量表示米酒中總糖的含量。

總酸的測定：采用國標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，用酚酞作為滴定的指示劑，以0.1 mol/L（精確至0.0001）的氫氧化鈉為標(biāo)準(zhǔn)溶液對樣品進(jìn)行滴定，以每百毫升樣品中酸的質(zhì)量表示其總酸含量，以每1000 mL 中酸的質(zhì)量表示米酒中總酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 根霉的分離與純化

在馬鈴薯瓊脂固體培養(yǎng)基(PDA)中經(jīng)過多次分離與純化后，從兩個地區(qū)酒曲中共分離出2 株根霉菌，經(jīng)鑒定后均為少根根霉（Rhizopus arrhizus），編號為Rhi-1(貴陽)和Rhi-2（江西）。

2.2 根霉不同形態(tài)下的觀察

將分離所得的Rhi-1和Rhi-2菌株采用PDA培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)3 d 后，發(fā)現(xiàn)Rhi-1 根霉由營養(yǎng)菌絲體產(chǎn)生匍匐菌絲向四周蔓延，菌落濃密，有放射狀溝紋，棉花狀，呈白色，上半部分為黑褐色，菌絲與培養(yǎng)基連接緊密，生長較旺盛；Rhi-2 菌絲較為疏松，有放射狀溝紋，亦呈現(xiàn)出棉絮狀，較為濃密，整體呈黑褐色，菌絲與培養(yǎng)基連接緊密，生長較旺盛。3種根霉顯微鏡下形態(tài)的觀察結(jié)果見圖1。

圖1 3株根霉顯微鏡下形態(tài)（10×40）

2.3 根霉發(fā)酵能力對比

糖化、液化能力是衡量發(fā)酵能力的重要指標(biāo)[21]，3株根霉（干曲）的糖化力、液化力對比見表1。

由表1 可知，液化力Rhi-1＞Q303＞Rhi-2，糖化力Rhi-1＞Q303＞Rhi-2，Rhi-1 與Q303 發(fā)酵性能較優(yōu)異，Rhi-2 相對較弱。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇Rhi-1菌株與Q303菌株做發(fā)酵產(chǎn)物的比較分析。

表1 根酶曲的酶活力測定結(jié)果

2.4 根霉發(fā)酵產(chǎn)物分析

使用GC-MS 技術(shù)對2 種不同根霉的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測，主要成分的GC-MS 色譜圖見圖2，相對含量的分析結(jié)果見表2。

圖2 根霉Q303(a)、Rhi-1(b)發(fā)酵產(chǎn)物主要風(fēng)味成分GC-MS分析總離子流色譜圖

由表2 可知，2 種不同發(fā)酵液共檢測到22 種主要風(fēng)味化合物，且2 株根霉產(chǎn)生最多的均是醇類。其中Q303醇類8種，Rhi-1醇類8種，兩種根霉發(fā)酵產(chǎn)物差異不明顯，但其相對含量有較明顯區(qū)別。Q303 和Rhi-1 發(fā)酵產(chǎn)物中相對含量最多的醇類是異戊醇，其次是β-苯乙醇，Rhi-1 的β-苯乙醇相對含量約為Q303 的2 倍。β-苯乙醇不僅具有良好的抗菌性能，且香味濃烈，有玫瑰花香和木香[22]。Rhi-1 中也檢測出含量高于Q303 的3-羥基-2-丁酮（乙偶姻），乙偶姻具有特殊的奶香味、蜂蜜般的甘甜味，是調(diào)香過程中極為重要的一種物質(zhì)，也是酒中一種主要的香氣成分，在名酒中的含量尤其高。Rhi-1 檢測出特有的物質(zhì)異己酸乙酯，若酒中含有微量的α-羰基（或羥基）異己酸乙酯時，與異戊醇共存會使酒的香氣更為強(qiáng)烈，能豐富酒體的香氣成分。醇類化合物是具有芳香氣味的化合物，具有蜜香玫瑰味。Rhi-1在風(fēng)味化合物的豐度和含量上較Q303有一定的優(yōu)勢。

表2 根霉主要發(fā)酵產(chǎn)物種類及相對含量

2.5 根霉曲試飯發(fā)酵特性的研究

利用Q303、Rhi-1 兩株根霉制作好的根霉曲，對蒸熟的糯米進(jìn)行糖化發(fā)酵試驗(yàn)，在34 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，分別取24 h、32 h、40 h、48 h、60 h的米酒樣品。對得到的米酒樣品分別測定糖化酶活力、液化酶活力、總糖、總酸，探究2 株根霉的發(fā)酵特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

由圖3（a）可知，Q303 根霉曲在24 h 時糖化酶活力較高，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，糖化酶活力呈增長的趨勢，在32 h 時糖化酶活力達(dá)到256 mg/h·g，隨后有下降的趨勢，發(fā)酵時間在40～48 h 時糖化酶活力下降較快，兩個時間段差值達(dá)到了102.5 mg/h·g，最后在48～60 h 時趨于平穩(wěn)。Rhi-1 根霉曲在32 h時糖化酶活力高于Q303，達(dá)到了278.3 mg/h·g，后期下降并趨于穩(wěn)定。說明Rhi-1 是一株有著良好糖化力的根霉，Q303 與Rhi-1 的變化趨勢大致相同。

圖3 兩種曲不同發(fā)酵階段米酒的各項指標(biāo)

由圖3（b）可知，Rhi-1 根霉曲在24 h 時，液化酶活力與Q303 根霉曲差距不明顯，但在32 h 時，液化酶活力最強(qiáng)且高于Q303 根霉曲，此時，Rhi-1 根霉曲的液化酶活力達(dá)到0.197 g/h·g。Q303 根霉曲和Rhi-1 根霉曲的液化酶活力呈先增后降的趨勢，均在32 h 最高。證明Rhi-1 根霉曲是一株液化能力非常好的甜酒曲。

由圖3（c）可知，Rhi-1 根霉曲所得發(fā)酵酒的總糖含量是2 種發(fā)酵酒中最高的，在40 h 時達(dá)到了181.5 g/L，此時由Q303 根霉曲制成的發(fā)酵酒總糖為159.6 g/L。2株根霉菌曲所得發(fā)酵酒的總糖含量呈先增加后下降趨勢，均在40 h 達(dá)到峰值。印證了Rhi-1 根霉曲和Rhi-2 根霉曲的糖化力在32～40 h階段是最高的，在這一時間段，大量的淀粉被轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在發(fā)酵后期兩者總糖含量均有不同程度的下降，可能是一些酒化酶將還原糖轉(zhuǎn)化為乙醇的緣故。

由圖3（d）可知，在發(fā)酵初期，Q303 根霉曲產(chǎn)酸能力強(qiáng)于Rhi-1，其中Q303 根霉曲所得發(fā)酵酒總酸為27.2 g/L，Rhi-1 為23.3 g/L。Q303 根霉曲和Rhi-1 根霉曲所得發(fā)酵酒的總酸含量變化趨勢接近，均在40 h 含量最高，在該時間段Rhi-1 根霉曲所得發(fā)酵酒的總酸含量高于Q303，分別為38.5 g/L、34.1 g/L。2 株根霉制曲所得發(fā)酵酒的總酸在整個發(fā)酵過程中變化較小，可能與單一的根霉菌種有關(guān)。

3 結(jié)論

從貴州土曲和江西酒曲中分離篩選出2 株根霉菌Rhi-1、Rhi-2，經(jīng)菌落形態(tài)觀察和顯微觀察，初步鑒定為根霉種。將其與傳統(tǒng)優(yōu)秀菌株Q303 做比對，經(jīng)初步篩選，Rhi-1 是一株糖化力、液化力性能良好的根霉。將Rhi-1 與Q303 進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物及根霉曲試飯發(fā)酵特性研究。結(jié)果表明，這兩株根霉在發(fā)酵產(chǎn)物、理化特性、以及酒釀的各項指標(biāo)方面都有差異，但在產(chǎn)酸能力上差異較小。Rhi-1 液化能力、糖化能力均高于Q303，是一株發(fā)酵性能良好的根霉菌株，后期可尋求方法以進(jìn)一步提高其發(fā)酵性能。純種根霉菌制曲發(fā)酵所得米酒穩(wěn)定安全，但其風(fēng)味較單一，酒體沒有層次感，可能是菌種單一，酶系豐度不夠。有研究發(fā)現(xiàn)，多種酵母與霉菌復(fù)配發(fā)酵米酒可產(chǎn)生獨(dú)特香味成分[23]，況啟生等[24]用不同菌種混合制曲生產(chǎn)多種風(fēng)味的米酒；張新武等[25]從客家糯米酒藥曲中分離出兩株根霉和酵母，通過復(fù)配開發(fā)得到了強(qiáng)化曲。后期可圍繞根霉Rhi-1 進(jìn)行更深層次的研究，探究提高其發(fā)酵性能的方法以及多菌種復(fù)合制造酒曲的可能性以豐富米酒的風(fēng)味及口感。