毛志海，殷想想，占 成，常 煦，方尚玲

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430068；2.湖北安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443000)

濃香型白酒是中國四大基礎(chǔ)酒之一，典型特征就是采用泥窖固態(tài)發(fā)酵[1-2]。濃香型白酒經(jīng)泥窖發(fā)酵、蒸餾、勾調(diào)而成，窖泥中微生物豐富是濃香型白酒酯類豐富的主要原因之一，己酸乙酯是酒體中主要的呈香物質(zhì)，所以濃香型白酒以己酸乙酯為主體香[3]。乳酸乙酯也是濃香型白酒中最重要的呈香物質(zhì)之一，濃香型白酒中含有適量的乳酸乙酯可以提高白酒的品質(zhì)，過高或過低可能會(huì)導(dǎo)致濃香型白酒主體香味不突出和酒體粗糙[4]。

在白酒的釀造過程中，環(huán)境十分復(fù)雜，產(chǎn)乳菌產(chǎn)生過量的乳酸，導(dǎo)致酒體中乳酸含量過高，和乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成大量的乳酸乙酯，過量的乳酸乙酯是影響白酒風(fēng)味和品質(zhì)的重要指標(biāo)[5-6]。乳酸乙酯性質(zhì)穩(wěn)定，一旦形成很難分解，所以只能減少乳酸乙酯的前體物質(zhì)“乳酸”來達(dá)到降低乳酸乙酯的目的[7-8]。

本研究通過對(duì)老窖泥的篩選分離，篩選出能夠利用乳酸的微生物。通過鏡檢、分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，然后進(jìn)行乙醇的耐受性、pH 的耐受性、葡萄糖存在條件下對(duì)乳酸的消耗情況研究，以期為將該菌株應(yīng)用到白酒中打下基礎(chǔ)，為濃香型或清香型白酒提高品質(zhì)提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

窖泥：湖北省某酒廠優(yōu)質(zhì)窖泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

乳酸鈉培養(yǎng)基：1 %乳酸鈉，1 %(NH4)2SO4，0.2 %酵母膏，0.5 %（NH4)2HPO4，配固體需要加入2%的瓊脂。115 ℃滅菌20 min。

乳酸鈉葡萄糖培養(yǎng)基：1 %乳酸鈉，0.5 %葡萄糖，1 %(NH4)2SO4，0.2 %酵母膏，0.5 %（NH4)2HPO4。配固體需要加入2 %的瓊脂，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 儀器設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，浙江金壇市富華儀器有限公司；LDZX-50KBS 高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；2.5 L 厭氧培養(yǎng)袋，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；WFJ 2000 分光光度計(jì)，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；SBA-40D 傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；Thermo U3000 HPLC，賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初篩

取10 g 窖泥放入90 mL 滅過菌的生理鹽水中，振蕩15 min，用紗布過濾，得到的過濾液進(jìn)行梯度稀釋（10-2、10-3、10-4、10-5），取每個(gè)稀釋梯度液，使用涂布棒涂布于乳酸鈉固體培養(yǎng)皿中，34 ℃培養(yǎng)24 h，挑選能在乳酸鈉培養(yǎng)基上生長的微生物單菌落。

1.2.2 復(fù)篩

將挑取的單菌落涂布于乳酸鈉固體培養(yǎng)皿中，每個(gè)挑取的單菌落至少劃線3 次以上，得到的單菌落可以基本確定為能夠利用乳酸的微生物，挑選單菌落進(jìn)行鏡檢，觀察其形態(tài)特征[9]。

1.2.3 優(yōu)良乳酸利用菌的篩選

將復(fù)篩得到的6 株乳酸利用菌，接入乳酸鈉培養(yǎng)液中活化24 h，按照5%的接種量，將6 株菌株分為2 組，分別接種到乳酸鈉液體培養(yǎng)基中。1 組在恒溫?fù)u床中進(jìn)行有氧培養(yǎng)，另一組在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行深層液體厭氧培養(yǎng)，每個(gè)組的菌株都在34 ℃下培養(yǎng)3 d，每個(gè)菌株做3個(gè)平行試驗(yàn)。

取每個(gè)菌株第1 d 和最后1 d 培養(yǎng)液各2 mL，使用高效液相色譜測樣品中的乳酸含量，通過2 次乳酸差值計(jì)算出各菌株的乳酸利用量，選擇對(duì)乳酸利用較好的菌株進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.2.4 優(yōu)良乳酸利用菌發(fā)酵性能的測試

1.2.4.1 葡萄糖對(duì)乳酸利用菌的影響

白酒釀造過程中含有一定的葡萄糖，因此在葡萄糖存在的條件下利用乳酸是菌株作為乳酸利用菌的重要指標(biāo)[10]。

將篩選得到的優(yōu)良乳酸利用菌，接種到乳酸鈉培養(yǎng)液中活化24 h，按照5%的接種量，將菌株活化培養(yǎng)液接種到乳酸鈉葡萄糖液體培養(yǎng)基中，34 ℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3 d，1 組進(jìn)行有氧培養(yǎng)，1 組進(jìn)行深層厭氧培養(yǎng)，每個(gè)菌株各做3 個(gè)平行。取第1 d和第3 d 發(fā)酵液各2 mL，使用高效液相色譜測發(fā)酵液乳酸含量和通過生物傳感分析儀測發(fā)酵液葡萄糖含量。

1.2.4.2 優(yōu)良乳酸利用菌pH值耐受性的測試

將乳酸利用較好的兩株菌株進(jìn)行活化，活化好的菌液分別按照5%的接種量，接種在pH值為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5 的乳酸鈉培養(yǎng)液中。在34 ℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行有氧培養(yǎng)3 d，每個(gè)梯度做3 個(gè)平行試驗(yàn)，從1 d 開始取樣，每天取樣2 mL，通過測定培養(yǎng)液的OD600值，判斷菌株生長狀態(tài)。

1.2.4.3 優(yōu)良乳酸利用菌乙醇耐受性的測試

將優(yōu)良乳酸利用菌活化好的培養(yǎng)液，按照5%的接種量，分別接種在含有不同濃度梯度乙醇（0%、1 %、2 %、3 %、4 %、5 %）的乳酸鈉培養(yǎng)液中[11]。在34 ℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行有氧培養(yǎng)3 d，每個(gè)梯度做3 個(gè)平行試驗(yàn)，從1 d 開始取樣，每天取樣2 mL，測培養(yǎng)液OD600的值。

1.2.5 發(fā)酵液分析方法

1.2.5.1 乳酸的測定方法

乳酸的測定采用高效液相色譜法[12]。樣品處理：取100 μL 發(fā)酵液加入到900 μL 超純水中稀釋10 倍，用0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾，將濾液裝入進(jìn)樣瓶中進(jìn)樣。

1.2.5.2 葡萄糖含量的測定方法

葡萄糖含量[13]：使用生物傳感儀進(jìn)行測定。用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)，將稀釋10 倍后的樣品，用微量進(jìn)樣器取25 μL注入生物傳感儀測定。

1.2.5.3 樣品菌液濃度的測定方法

使用分光光度計(jì)，用光密度（OD600值）表示樣品菌液濃度。

1.2.6 優(yōu)良耗乳菌的菌種鑒定

（1）試劑盒提取基因組DNA；（2）PCR 擴(kuò)增16S rDNA：96 ℃預(yù)變性5 min，96 ℃變性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)，72 ℃保溫10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測，觀察條帶性狀；（3）將PCR 產(chǎn)物送到華大基因測序。將測序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST比對(duì)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸利用菌的培養(yǎng)結(jié)果

將能夠在乳酸鈉培養(yǎng)基上生長的菌株，根據(jù)其菌落特征分為6 種不同類型的乳酸利用菌，初步命名為：R-0、R-1、R-2、R-3、R-4、R-5。見表1。

表1 篩選乳酸利用菌的菌落和鏡檢結(jié)果

從表1 可看出，6 株微生物的細(xì)胞都是桿狀，菌落有所差異。R-0：菌落小、呈橢圓形、表面光滑；R-1：菌落大而粗燥、與培養(yǎng)基結(jié)合、不透明、菌落黃色；R-2：菌落小、濕潤、表面光滑；R-3：菌落小、表面光滑、菌落呈淺黃色；R-4：菌落白色、小而光滑、邊緣齊整；R-5：菌落呈白色、不透明、邊緣呈花瓣?duì)睢?/p>

2.2 乳酸利用菌的篩選結(jié)果

培養(yǎng)基在滅菌過程中乳酸會(huì)有一定的揮發(fā)，所以樣品滅菌接種后從0 d開始取樣。

如表2 所示，在有氧且同樣培養(yǎng)3 d 的條件下，6株菌株對(duì)乳酸的利用率基本都是100%。

表2 有氧培養(yǎng)3 d各菌株乳酸的消耗量

如表3 所示，在厭氧條件下，R-2 和R-3 菌株對(duì)乳酸的利用和其他菌株相比具有優(yōu)勢，R-2 和R-3對(duì)乳酸的利用率為12.9 %和16.0 %，R-0、R-1、R-4、R-5 對(duì)乳酸的利用率為10.4 %、12.0 %、7.1 %、10.6%。

表3 無氧培養(yǎng)3 d各菌株乳酸的消耗量

由以上結(jié)果分析得出，在有無氧條件下，6株微生物都可以利用乳酸，R-2 和R-3 菌株在厭氧條件下對(duì)乳酸的利用比其他菌株好。微生物在窖池的生長條件大部分都是厭氧的，因此選擇R-2 和R-3在厭氧條件下利用乳酸最多的菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 葡萄糖對(duì)乳酸利用菌的影響結(jié)果

如圖1 所示，在有氧條件下，R-2 和R-3 分別利用乳酸2.16 g/L（28 %）和2.99 g/L（40 %），在相同的培養(yǎng)條件下，R-3 對(duì)乳酸的利用率比R-2 高12 %；在無氧條件下，R-2 和R-3 分別利用乳酸0.65 g/L（8.6 %）和0.73 g/L（9.7 %），R-3 對(duì)乳酸的利用率比R-2高1.1%。

圖1 R-2和R-3有氧無氧下培養(yǎng)3 d乳酸的消耗量及利用率

如圖2 所示，在有氧條件下，R-2 和R-3 各利用葡萄糖1.25 g/L（46%）和1.37 g/L（50.7%），R-3 對(duì)葡萄糖的利用率比R-2高4.7%；在無氧條件下，R-2 利用葡萄糖0.99 g/L（37 %），R-3 利用葡萄糖1.13 g/L（42 %），R-3 對(duì)葡萄糖的利用率比R-2 高5%。

圖2 R-2和R-3有氧無氧下培養(yǎng)3 d葡萄糖的消耗量及利用率

由上所述，R-2 和R-3 在葡萄糖存在時(shí)同樣可以利用乳酸，R-3 比R-2 在葡萄糖存在時(shí)對(duì)乳酸的利用更好。

2.4 pH值耐受性測的結(jié)果

如圖3 所示，將R-2 和R-3 在34 ℃條件下培養(yǎng)3 d，R-3 菌株在初始pH 值為6.5、7.5、8.5 時(shí)，OD600值都隨著時(shí)間的延長而上升，初始pH 值為8.5 時(shí)OD600值增長最高，R-3 菌株在初始pH 值為5.5 和9.5 時(shí)，OD600值隨著時(shí)間的延長基本沒有變化。這表明R-3 菌株可以在pH 值為6.5～8.5 的培養(yǎng)液中正常生長，最適pH為8.5。

圖3 pH對(duì)菌株生長的影響

與R-3 菌株相比，R-2 菌株只有在初始pH 值為5.5 時(shí)OD600值基本不變，在初始pH 值為6.5、7.5、8.5、9.5 時(shí)，OD600值都隨著時(shí)間的延長一直上升，特別是在初始pH 值為8.5 時(shí)OD600值增長最高，這表明R-2 菌株可以生長的pH 值范圍是6.5～9.5，最適生長pH值為8.5。

綜上所述，R-2和R-3菌株可以正常生長的pH值范圍為6.5～9.5。據(jù)報(bào)道，窖泥中的pH 值在5.86～9.22 范圍內(nèi)變化，完全符合這兩株乳酸利用菌對(duì)pH值的生長需求[15-17]。

2.5 乙醇耐受性結(jié)果

將R-2 和R-3 菌株接種于含有乙醇濃度為0 %、1 %、2 %、3 %、4 %、5 %的乳酸鈉培養(yǎng)基中，34 ℃下有氧培養(yǎng)3 d，結(jié)果如圖4所示。

圖4 乙醇濃度對(duì)菌株生長的影響

R-3 菌株在接種后就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，R-2 菌株在1 d 時(shí)才開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期；R-2 和R-3 菌株在乙醇含量為0 %～4 %時(shí)，OD600值都可以快速增長；在乙醇含量為5%時(shí)，2 菌株受乙醇的抑制較為明顯，OD600值增長較為緩慢。2 菌株在乙醇含量為0%～4%可以快速生長，與鎮(zhèn)達(dá)等[18]研究6 株乳酸利用菌對(duì)乙醇的耐受性結(jié)果基本一致。

結(jié)果表明，2 菌株都可以耐受5 %以下的乙醇含量，R-3 比R-2 菌株能更快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，說明R-3比R-2菌株能夠更快適應(yīng)生長環(huán)境。

2.6 菌種鑒定結(jié)果

R-3 和R-2 菌株的16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5 所示，孔號(hào)1 是R-3 菌株，孔號(hào)2 是R-2 菌株，測序結(jié)果在Genbank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，R-2 為賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillussp.），R-3為熱帶桿菌（Bacillus tropicus）。

由圖5 可知，R-2 和R-3 菌株經(jīng)過PCR 擴(kuò)增得到了高質(zhì)量的擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物測序，選取相似度高的比對(duì)結(jié)果使用MEGA6 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖6所示。

圖5 R-3和R-2菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果

由圖6 可知，R-2 菌株與芽孢桿菌相似度最高，R-3菌株與熱帶桿菌相似度最高。

圖6 R-2和R-3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

通過對(duì)老窖泥的分離篩選，得到了6 株能夠利用乳酸的菌株。選擇R-2 和R-3 這兩菌株在厭氧條件下對(duì)乳酸利用較好的微生物進(jìn)行研究。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定R-2 為賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillussp.），R-3 為熱帶桿菌（Bacillus tropicus），R-2 和R-3 菌株在34 ℃都可以耐受5%的乙醇含量，R-2菌株pH 生長范圍是6.5～8.5，R-3 菌株pH 生長范圍是6.5～9.5，最適生長pH 都是8.5；在葡萄糖存在時(shí)兩菌株仍然可以利用乳酸，有氧時(shí)，R-3 對(duì)乳酸的利用率比R-2 高12 %，厭氧時(shí)，R-3 對(duì)乳酸的利用率比R-2 高1.1%。兩菌株對(duì)白酒降低乳酸乙酯有一定的應(yīng)用與參考價(jià)值。