鄧幫福，范俊俠，姚麗華，張 哲

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013）

1 前言

生物體在進行生命活動時需要金屬離子作為蛋白質(zhì)的輔助因子[1]。Nramp 蛋白是一種具有典型多肽分子的膜轉(zhuǎn)運蛋白，其跨膜結(jié)構(gòu)域是Nramp 蛋白參與生物體跨膜運輸與金屬離子的轉(zhuǎn)運和利用的關(guān)鍵[2，3]。Nramp 轉(zhuǎn)運蛋白可以特異選擇一種或多種金屬來進行轉(zhuǎn)運。目前發(fā)現(xiàn)其可以轉(zhuǎn)運Mn2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Co2+、As2+和Ni2+等離子。Nramp 蛋白在動物中被廣泛研究，主要探究了Nramp 蛋白抗侵染病原微生物作用機制[4]。Nramp 蛋白也廣泛存在于植物中，它對植物轉(zhuǎn)運金屬離子和維持離子平衡起著重要作用[5]。Nrmap 蛋白在微生物中也具有金屬轉(zhuǎn)運活性[6]，釀酒酵母中有3 個編碼Nramp 家族蛋白的基因：SMF1、SMF2 和SMF3，它們在釀酒酵母中都參與金屬離子的轉(zhuǎn)運[7]。

曲酸是一種主要由米曲霉合成的具有多種生物活性的有機酸，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、美容等行業(yè)[8，9]。米曲霉曲酸的合成調(diào)控與轉(zhuǎn)運蛋白密切相關(guān)。轉(zhuǎn)運蛋白KojT 參與轉(zhuǎn)運曲酸到胞外[10]。進一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運蛋白AoKap4 與KojT 協(xié)同參與曲酸的轉(zhuǎn)運[11]。此外，其他轉(zhuǎn)運蛋白，如AoKap1、AoKap2 和NrtA 也被發(fā)現(xiàn)參與曲酸合成[12，13，14]。米曲霉中Nramp 轉(zhuǎn)運蛋白基因AoNramp1 已被克隆[4]，但AoNramp1 作為轉(zhuǎn)運蛋白是否也會影響曲酸合成，目前尚無報道。

本研究首先利用米曲霉α 淀粉酶基因amyB 啟動子構(gòu)建了AoNramp1 過表達菌株，然后對比分析了其與野生型3.042 菌株在不同離子處理下的菌絲生長情況和孢子數(shù)目形態(tài)。同時，分析了其對米曲霉曲酸合成的影響，以期為全面理解米曲霉Nramp家族基因的功能提供參考。

2 實驗部分

2.1 菌株與培養(yǎng)基

米曲霉3.042 菌株（CICC 40092）作為野生型菌株。Czapek-Dox（CD）培養(yǎng)基（2%可溶性淀粉、0.2%NaNO3、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4、0.05% KCl、0.05%NaCl、0.002% FeSO4，pH 5.5）作為表型觀察和曲酸發(fā)酵的培養(yǎng)基。

2.2 過表達載體的構(gòu)建

以米曲霉3.042 基因組DNA 為模板，使用引物pEX2B-AoNramp1-F/R，通過PCR 擴增獲得AoNarmp1片段。重組質(zhì)粒pEX2B-AoNramp1 是將該片段通過同源重組連接到線性化的pEX2B 載體[15]。該載體攜帶有米曲霉α 淀粉酶基因amyB 啟動子和trpC 終止子。PEG 原生質(zhì)體法可將測序后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到米曲霉3.042 的ΔpyrG 菌株中。PCR 法可驗證AoNramp1過表達菌。

2.3 聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

米曲霉轉(zhuǎn)化采用改進的PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[16]。首先用DPY 培養(yǎng)基（2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母抽提物、0.5% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O，pH 5.5）培養(yǎng)米曲霉，30°C 培養(yǎng)20 h 后收集菌絲，用含有50 mM 馬來酸（pH 5.5）和0.6 M（NH4）2SO4的溶液洗滌2 次，瀝干；然后用過濾除菌的酶解溶液（50 mM 馬來酸、1%Yatalase、0.5%Lysing enzymes、0.6 M（NH4）2SO4，pH 5.5）與菌絲混合，60～70 rpm 攪拌，30°C 避光裂解3 h 后，加入等體積的轉(zhuǎn)化溶液（1.2 M sorbitol、50 mM CaCl2·2H2O、35 mM NaCl、10 mM pH=7.5 的Tris-HCl 溶液）搖晃幾次，將上述酶液通過滅菌的雙層擦鏡紙過濾，用圓底管收集過濾液，4° C 離心收集原生質(zhì)體。用轉(zhuǎn)化溶液洗滌原生質(zhì)體一次，再離心收集，放在冰上，備用。將備好的質(zhì)粒（10 μg）與該原生質(zhì)體（200 μL）混勻。冰浴30 min，然后分3 次分別加入250 μL、250 μL、850 μL PEG溶 液（60%PEG 4000、50 mM CaCl2·2H2O、10 mM pH=7.5 的Tris-HCl 溶液）混勻后避光放置20 min。隨后用適量轉(zhuǎn)化溶液終止反應(yīng)；離心收集原生質(zhì)體，倒入適量的Top MM 培養(yǎng)基（0.2%NH4Cl、0.1%（NH4）2SO4、0.05% KCl、0.05% NaCl、0.1% KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.002% FeSO4·7H2O、2% glucose、0.15% methionine、l.2 M sorbitol、0.8% agar，pH 5.5）混勻，最后將上述Top MM 培養(yǎng)基平鋪在MM 培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3～5 天。

2.4 表型分析

菌株孢子液接種到CD 培養(yǎng)基上，在30 °C 培養(yǎng)3 天后進行表型分析。在CD 培養(yǎng)基中分別加入200 μM ZnSO4、200 μM FeSO4、200 μM MnSO4、200 μM CuSO4用作不同金屬離子處理米曲霉。十字交叉法用于測定菌絲生長直徑。洗孢液（0.025%Tween 80、0.8%NaCl）被用于收集菌落孢子，并通過血球計數(shù)板計算孢子數(shù)目。每個實驗都進行了三個生物學(xué)重復(fù)。

2.5 RNA 的提取

收集的菌絲樣品經(jīng)液氮處理后研磨成粉末。按照真菌總RNA 提取試劑盒（Omega，R6840）說明書提取總RNA。

2.6 表達量分析

提取的RNA 用gDNA Eraser（TaKaRa）去除基因組DNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）進行qPCR，使用的定量試劑盒是SYBR Green PCR Kit（TaKaRa）。米曲霉Histone H1基因（AO090012000496）作為內(nèi)參基因。所有實驗均重復(fù)三次。

2.7 曲酸含量的測定

將100 μL 米曲霉菌株的分生孢子懸浮液（108個/mL）接種到含有40 mL 改良CD 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中；在30°C 下培養(yǎng)7 天后，收集上清液，用FeCl3顯色法[4]測定曲酸的濃度（mg/mL）；取0.5 mL 發(fā)酵液，與1 mL FeCl3-HCl 溶液（0.06 M FeCl3、0.27 M HCl）混合，然后加0.5 mL 雙蒸水混勻后，使用酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）在500 nm 處測定混合液的吸光度；用雙蒸水代替曲酸發(fā)酵液作為對照組；依據(jù)上述顯色反應(yīng)體系繪制曲酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線（0～0.4 mg/ml）；利用測定的混合液吸光度和曲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出曲酸的濃度。同時，收集培養(yǎng)7 天后菌絲體，并在65 °C 下干燥至恒重，曲酸的含量（mg/mL·g）等于曲酸的濃度除以生物量。

3 結(jié)果與討論

3.1 過表達AoNramp1 對米曲霉生長的影響

為了研究AoNramp1 在米曲霉生長中的作用，本文利用米曲霉α 淀粉酶基因amyB 啟動子構(gòu)建了2 株AoNramp1 過表達菌株：OE-1 和OE-8（圖1AC）?；虮磉_分析顯示，相對于野生型，OE-1 和OE-8 中AoNramp1 的表達提高了28 倍（圖1B）。為了探究在金屬離子處理下過表達AoNramp1 對米曲霉生長的影響，本文選用200 μM ZnSO4、200 μM FeSO4、200 μM MnSO4、200 μM CuSO4分別處理了野生型WT、OE-1 和OE-8 菌株。相比之下，過表達AoNramp1菌株比野生型菌株的的菌絲生長直徑明顯變?。▓D1C，D）；而且過表達AoNramp1 菌株的濕重比野生型菌株的?。▓D1E）。Zn2+處理增加野生菌株的濕重，而Zn2+對過表達AoNramp1 菌株的濕重?zé)o明顯促進作用，表明AoNramp1 基因與Zn2+相關(guān)。而Cu2+對野生型菌株和過表達AoNramp1 菌株的濕重都有明顯抑制作用。這些結(jié)果表明，過表達AoNramp1 抑制了米曲霉菌絲生長，而Zn2+促進了米曲霉菌絲生長，且AoNramp1 與Zn2+有關(guān)。

圖1 過表達AoNramp1 對米曲霉生長的影響：（A）利用米曲霉α 淀粉酶基因amyB 啟動子過表達AoNramp1 基因的示意圖；野生型（WT）與AoNramp1 過表達菌株（OE-1 和OE-8）中的AoNramp1基因表達水平（B），在不同金屬處理下的菌絲生長情況（C）和生長直徑（D）及菌絲濕重（E）

3.2 過表達AoNramp1 對米曲霉孢子生長的影響

在與上文同樣的實驗條件下，本文研究發(fā)現(xiàn)過表達AoNramp1 菌株的孢子數(shù)顯著少于野生型菌株（圖2A，B），但不同金屬離子對孢子形成的影響是不一樣的。Cu2+會抑制米曲霉孢子的形成，而Zn2+、Fe2+、Mn2+則能促進米曲霉孢子的形成，其中Mn2+顯著促進野生型菌株產(chǎn)孢子，而Fe2+顯著促進過表達AoNramp1 菌株產(chǎn)孢子（圖2A，B），這說明過表達AoNramp1 影響Fe2+、Mn2+對米曲霉孢子形成。孢子大小測試結(jié)果顯示過表達AoNramp1 菌株顯著大于野生型菌株的孢子直徑（圖2C）。

圖2 過表達AoNramp1 對米曲霉孢子形成的影響：不同金屬處理后的野生型菌株（WT）與AoNramp1 過表達菌株（OE-1 和OE-8）的孢子顯微形貌（A）、孢子數(shù)量（B）、孢子直徑（C）

3.3 過表達AoNramp1 對米曲霉菌球生長的影響

在與上文同樣的實驗條件下，本文研究發(fā)現(xiàn)過表達AoNramp1 菌株的菌球直徑顯著大于野生型菌株（圖3 A，B），其中Fe2+、Cu2+對過表達AoNramp1菌株的菌球直徑增大效果較為顯著。菌球的干重分析結(jié)果顯示過表達AoNramp1 與野生型菌株無顯著性差異（圖3C）。這些結(jié)果表明，過表達AoNramp1增加了米曲霉在液體培養(yǎng)基中的菌球直徑，且Fe2+、Cu2+的促進效果最為明顯，但沒有影響米曲霉的生物量。

3.4 過表達AoNramp1 對米曲霉曲酸合成的影響

為了研究AoNramp1 對米曲霉曲酸合成的影響，本文將WT、OE-1 和OE-8 的孢子液接種在液體CD 曲酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 °C 培養(yǎng)7 天。曲酸能夠與Fe3+發(fā)生顯色反應(yīng)生成紅色復(fù)合物，從而定性分析菌株的曲酸合成情況。研究結(jié)果顯示AoNramp1過表達菌株比野生型菌株的顯色明顯較淺（圖4A），這表明過表達AoNramp1 抑制了曲酸的合成。AoNramp1 過表達菌株比野生型菌株的曲酸合成量顯著減少（圖4B）。曲酸合成相關(guān)基因kojA、kojR、kojT的表達分析表明，相對于野生型，過表達AoNramp1菌株中的基因表達量都顯著下調(diào)（圖4C-E）。這些結(jié)果表明，AoNramp1 可能是通過抑制曲酸合成相關(guān)基因的表達來抑制米曲霉曲酸的合成。這種抑制作用可能來自Zn2+的影響[17-19]。

圖4 過表達AoNramp1 對米曲霉曲酸合成的影響：野生型菌株（WT）與AoNramp1過表達菌株（OE-1 和OE-8）所產(chǎn)的曲酸顯色反應(yīng)（A），曲酸含量（B）；野生型與AoNramp1過表達菌株中曲酸合成相關(guān)基因kojA（C）、kojR（D）和kojT（E）的表達水平

4 結(jié)論

總之，本文研究表明過表達AoNramp1 會抑制米曲霉菌絲的生長，而Zn2+會促進米曲霉菌絲的生長，且AoNramp1 與Zn2+有關(guān)；過表達AoNramp1 使得米曲霉孢子數(shù)減少、孢子直徑增大，且Cu2+作用最為明顯；過表達AoNramp1 增加了米曲霉在液體培養(yǎng)基中的菌球直徑，且Fe2+、Cu2+的促進效果最為明顯，但不影響米曲霉的生物量；AoNramp1 可能是通過抑制曲酸合成相關(guān)基因kojA、kojR、kojT 的表達來抑制米曲霉曲酸的合成。本研究為理解Nramp 蛋白在米曲霉生長和曲酸合成中的作用提供了一定的參考。