李彥寧，王建華，崔云峰，王海明，王雙輝，樊 寧

原發(fā)性肝癌是全球范圍內(nèi)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居我國惡性腫瘤第5位，占腫瘤相關(guān)致死性原因第2位[1-2]。肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占原發(fā)性肝癌病例的85%～90%[3]。目前研究報道，HCC的發(fā)生發(fā)展與病毒感染、肝硬化、過度飲酒及免疫失衡等因素密切相關(guān)[4]。盡管HCC已在診斷、治療及預(yù)后等方面取得了巨大進展，但是每年仍有70多萬病例死亡[5]，臨床效果尚不能令人滿意。因此，迫切需要研究發(fā)現(xiàn)更有效的潛在治療靶點和預(yù)后標志物，進一步了解HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制。

Obg樣ATP酶1(Obg-like ATPase 1, OLA1)是一種高度保守ATP/GTP酶，屬于翻譯因子相關(guān)(TRAFAC)亞類，Obg超家族中YchF亞群。OLA1在細菌、植物和哺乳動物等多數(shù)生物體內(nèi)泛表達，在細胞信號傳導(dǎo)及機體生長發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用[6]。研究表明，OLA1在乳腺癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌等多種惡性腫瘤中異常表達，其主要是通過調(diào)控腫瘤細胞增殖凋亡、浸潤和轉(zhuǎn)移等機制發(fā)揮作用[7]。但是目前在HCC中的研究罕見，因此關(guān)于OLA1在HCC發(fā)生發(fā)展的作用機制尚需進一步探討。

1 材料與方法

1.1 OLA1基因在HCC中的表達及預(yù)后分析 GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫可對TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中資料進行可視化分析。本研究利用GEPIA數(shù)據(jù)庫對OLA1基因與HCC信息進行交互分析，同時進行總體生存期(overall survival, OS)分析。Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/)是目前進行腫瘤相關(guān)生物學(xué)分析常用的基因芯片數(shù)據(jù)庫。本研究利用Oncomine數(shù)據(jù)庫的4個數(shù)據(jù)集，對OLA1基因在HCC中的表達情況進行Meta分析。

1.2 OLA1基因與HCC病例臨床特征的相關(guān)性分析 Kaplan-Meier(KM) Plotter數(shù)據(jù)庫(https://kmplot.com/analysis/)是一個能夠?qū)?0余種惡性腫瘤進行mRNA和miRNA預(yù)后評估的在線數(shù)據(jù)庫。本研究利用KM Plotter數(shù)據(jù)庫分析OLA1基因(RNA-Seq Id, 29789)表達與HCC病例臨床病理特征對OS和無進展生存期(progression-free survival,PFS)的影響，包括性別、TNM分期(AJCC 8版)、組織分化程度和血管侵犯。

1.3 OLA1基因上游miRNA預(yù)測及miRNA差異表達和生存分析 starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)數(shù)據(jù)庫是研究非編碼RNA(ncRNA)常用數(shù)據(jù)庫之一。本研究利用starBase數(shù)據(jù)庫篩選獲得OLA1基因上游微小RNA(microRNA, miRNA)，提取 PITA、RNA22、miRmap、microT、miRanda、PicTar及TargetScan三個以上程序中預(yù)測陽性的miRNAs。進一步行相關(guān)性分析，獲得與OLA1顯著負相關(guān)的miRNA，并進行差異表達分析。利用KM Plotter數(shù)據(jù)庫對顯著差異表達miRNA進行生存分析。

1.4 miRNA相關(guān)lncRNA預(yù)測及l(fā)ncRNA差異表達和生存分析 利用starBase數(shù)據(jù)庫對此前已篩選獲得的miRNA進行其上游長鏈非編碼RNA(long non-coding,lncRNA)的預(yù)測篩選，設(shè)置參數(shù)：miRNA: miR-144-3p；pan-Cancer≥ 1；target: all，余為數(shù)據(jù)庫默認參數(shù)。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析starBase數(shù)據(jù)庫篩選獲取的lncRNA在HCC正常樣本和腫瘤樣本中的表達水平，同時進行OS分析。

1.5 lncRNA、miRNA及OLA1相關(guān)性分析 利用starBase數(shù)據(jù)庫進行HCC病例中l(wèi)ncRNA與miRNA和OLA1基因之間的相關(guān)性分析，并獲取相關(guān)系數(shù)R值和P值。將上述分析結(jié)果繪制成表格進行分析。

2 結(jié)果

2.1 OLA1基因在HCC中表達及預(yù)后結(jié)果 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫對OLA1基因在HCC中的表達情況進行Meta分析，結(jié)果顯示，4個研究中HCC腫瘤樣本OLA1基因表達水平均較正常樣本呈過表達狀態(tài)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，如圖1A。使用GEPIA在線工具，對TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中160例肝臟正常樣本和369例HCC樣本分析，結(jié)果顯示，OLA1基因在HCC組織中明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，如圖1B。進一步進行預(yù)后分析表明，OLA1基因表達水平與HCC病例預(yù)后呈顯著負相關(guān)(P＜0.01)，如圖2。

圖1 在線數(shù)據(jù)庫分析OLA1基因在HCC中表達水平

圖2 OLA1基因表達與HCC預(yù)后相關(guān)性分析

2.2 OLA1基因與HCC病例臨床特征相關(guān)性分析結(jié)果 利用KM Plotter數(shù)據(jù)庫對各個臨床病理參數(shù)進行逐個分析，獲得不同亞組中OLA1表達對OS及PFS的影響。分析過程中，組織學(xué)分級G4、大血管侵犯的病例數(shù)少，無法進行統(tǒng)計學(xué)分析。相關(guān)性分析結(jié)果表明，表達上調(diào)OLA1基因與性別、TNM分期、組織學(xué)分級和血管侵犯之間存在顯著相關(guān)性，見表1。

2.3 OLA1基因上游miRNA預(yù)測與分析結(jié)果 目前研究表明，ncRNA可以在基因表達過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。為明確HCC發(fā)生發(fā)展過程中ncRNA是否影響OLA1基因調(diào)控作用的發(fā)揮，本研究利用starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能潛在與OLA1基因結(jié)合的上游miRNA，最后獲得25個miRNA。利用Cytoscape軟件構(gòu)建miRNA-OLA1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如圖3A。獲取miRNA與OLA1基因的相關(guān)系數(shù)R值和P值，如圖3B?；趍iRNA調(diào)控靶基因的作用機制，獲得了與OLA1基因存在顯著負相關(guān)的miR-144-3p。進一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p在HCC組織中呈過度低表達狀態(tài)，且與預(yù)后顯著正相關(guān)，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，如圖3C和3D。

圖3 miR-144-3p篩選為OLA1潛在上游miRNA

2.4 miR-144-3p上游lncRNA預(yù)測與分析結(jié)果 利用starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-144-3p上游lncRNA，共預(yù)測獲得93個潛在lncRNA。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析93個lncRMA在HCC中的表達情況，在TCGA和GTEx兩個數(shù)據(jù)庫中均有統(tǒng)計學(xué)意義為有效lncRNA。結(jié)果顯示，DUXAP8、GAS5、LINC00665和 MALAT1共 4個 lncRNA在HCC樣本中較肝正常樣本呈過表達狀態(tài)，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，如圖4。本研究進一步分析了4個lncRNA在HCC中的預(yù)后價值。結(jié)果顯示，DUXAP8過表達的HCC患者，其OS預(yù)后較差；而MALAT1過表達的患者，其無病生存期(DFS)預(yù)后較差，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，如圖5。

圖4 HCC中miR-144-3p上游lncRNA的表達分析

圖5 HCC中 miR-144-3p上游lncRNA的預(yù)后分析

2.5 lncRNA與miR-144-3p和OLA1相關(guān)性分析結(jié)果 內(nèi)源競爭RNA假說是近年來lncRNA領(lǐng)域研究的熱點，其主要依據(jù)是lncRNA可以通過競爭性結(jié)合miRNA來增加mRNA的表達。因此，lncRNA與miRNA負相關(guān)且與mRNA正相關(guān)。本研究根據(jù)此理論進一步利用starBase數(shù)據(jù)庫，對上述4個lncRNA與miR-144-3p和OLA1之間的關(guān)系進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)DUXAP8與miR-144-3p無統(tǒng)計學(xué)差異，故將其去除；而MALAT1與miR-144-3p和OLA1基因關(guān)系密切。見表2。

表2 lncRNA與miR-144-3p和OLA1相關(guān)性分析

3 討論

HCC是常見的消化道惡性腫瘤，具有起病隱匿、腫瘤異質(zhì)性高、早期診斷困難和預(yù)后不良等生物學(xué)特征，5年生存率僅為12.5%[8]。我國HCC患病年齡具有年輕化趨勢，給社會發(fā)展和公共身體健康帶來了嚴重負擔(dān)和威脅。因此，深入研究HCC發(fā)病的分子機制，可以為尋找有效潛在治療靶點和發(fā)現(xiàn)可靠診斷預(yù)后生物標志物提供思路。研究表明，OLA1基因在結(jié)腸癌、胃癌及卵巢癌等多種惡性腫瘤中呈過表達狀態(tài)，且在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[9]。但是，OLA1基因在HCC發(fā)生和發(fā)展過程的分子機制及對預(yù)后的影響尚不明確。

OLA1基因在HCC中的表達和作用已有少量報道，但是多數(shù)研究均是通過體外試驗驗證。為明確OLA1在HCC中的表達情況，本研究首先利用Oncomine數(shù)據(jù)庫對多個數(shù)據(jù)集進行Meta分析，且利用TCGA和GTEx數(shù)據(jù)中HCC與OLA1基因相關(guān)數(shù)據(jù)進行交互驗證。兩種分析方法結(jié)果一致，均提示OLA1基因在HCC樣本中較正常肝樣本表達上調(diào)。提示OLA1基因在HCC患者機體內(nèi)環(huán)境中呈表達失調(diào)狀態(tài)，且可能在HCC進展過程中發(fā)揮著調(diào)控作用。生存分析表明，OLA1基因高表達HCC患者總體生存時間預(yù)后差，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步進行OLA與臨床病理特征相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)OLA表達水平與性別、TNM分期、組織學(xué)分級和血管侵犯之間關(guān)系密切，提示OLA1可作為HCC患者預(yù)后的分子標志物。Huang等[10]研究報道，OLA1基因通過調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等途徑，促進HCC進展。該研究結(jié)果與本研究分析一致，表明OLA1基因確實在HCC的進展中發(fā)揮著促癌作用，但其具體機制有待進一步研究。

眾所周知，ncRNA包括lncRNA、miRNA和環(huán)狀RNA(circRNA)，其在機體內(nèi)主要通過內(nèi)源性競爭機制調(diào)控基因表達。本研究利用PITA、RNA22、miRmap、microT、miRanda、PicTar 及TargetScan共7個預(yù)測程序，預(yù)測篩選出OLA1基因上游潛在miRNA共25個。目前有研究報道，多數(shù)miRNA在HCC中通過不同機制發(fā)揮腫瘤抑制作用。Tian等[11]研究表明，miR-144-3p過表達可以通過抑制肝癌細胞增殖、菌落形成及促進細胞凋亡等方式，調(diào)控肝癌細胞生物學(xué)功能。miR-48通過靶向調(diào)控Caspase-3、Caspase-9和Bax等多種途徑促進肝癌細胞凋亡，抑制HCC發(fā)生和發(fā)展[12]。miR-362-3p通過與Rab23和circMYLK相互作用，抑制肝癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。本研究通過對篩選獲取miRNA進行表達、預(yù)后和相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p在HCC樣本中明顯低表達，且與總體生存時間關(guān)系密切，為OLA1基因上游最佳潛在腫瘤抑制性miRNA。根據(jù)內(nèi)源競爭假說，本研究推斷miR-144-3p-OLA1軸上游lncRNA在HCC中可能起著促癌作用。本研究進一步對miR-144-3p-OLA1軸上游lncRNA預(yù)測，共篩選得到93個潛在lncRNA。綜合對各lncRNA表達、預(yù)后及相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MALAT1為潛在最佳上調(diào)lncRNA。既往研究報道，MALAT1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用。有研究顯示，MALAT1可以通過與MTOR/TCF7L2相互作用，調(diào)控HCC糖代謝，促進腫瘤進展[14]。Hou等[15]通過敲除肝癌細胞HepG2 和Huh-7中MALAT1后，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞分泌VEGF-a減少，促進巨噬細胞向M1極化，間接表明MALAT1具有促進腫瘤血管形成和抑制腫瘤免疫的生物學(xué)功能。這些研究結(jié)論與本研究分析結(jié)果一致，證實lncRNA MALAT1與miR-144-3p之間為負相關(guān)，與OLA1基因為正相關(guān)關(guān)系。

綜上所述，OLA1基因在HCC患者體內(nèi)高表達，且OLA1基因高表達與HCC患者不良預(yù)后正相關(guān)。HCC患者中OLA1基因上游調(diào)控機制可能是OLA1通過MALAT1-miR-144-3p軸發(fā)揮調(diào)控作用。結(jié)合既往關(guān)于OLA1基因、lncRNA MALAT1和miR-144-3p在HCC中的生物學(xué)功能，本研究認為MALAT1-miR-144-3p-OLA1軸在HCC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。OLA1基因和miR-144-3p可以作為HCC的預(yù)后標志物和潛在免疫治療靶點。