劉峻池，黃 鑫，楊 虹，白夢(mèng)茹，于豐碩

江蘇省南京市畜牧獸醫(yī)站，南京 210012

禽流感（avian influenza，AI）是由A 型流感病毒引起的人獸共患傳染病，根據(jù)其病毒致病力的不同，大體可分為高致病性禽流感（HPAI）、低致病性禽流感（LPAI）和非致病性禽流感[1-2]。高致病性禽流感的廣泛流行對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害極重，被OIE 列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病和A 類傳染病，我國(guó)則將其列為一類動(dòng)物疫病并實(shí)施強(qiáng)制免疫。高致病性禽流感病原主要為H5 亞型和H7 亞型，一旦感染家禽，發(fā)病率和死亡率均高，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大損失[3-5]。疫苗免疫是防控禽流感的重要手段，目前，我國(guó)強(qiáng)制免疫的禽流感疫苗為重組禽流感病毒H5+H7 三價(jià)滅活疫苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re3 株）[6-8]。

1 材料與方法

1.1 主要材料

禽血清，采自江蘇南京19 個(gè)家禽養(yǎng)殖場(chǎng)點(diǎn)；1%紅細(xì)胞懸液，自行配制；禽流感病毒H5 亞型Re-11株血凝抑制試驗(yàn)抗原（批號(hào)2020002）、禽流感病毒H5 亞型Re-12 株血凝抑制試驗(yàn)抗原（批號(hào)2021002）、禽流感病毒H7 亞型H7-Re3 株血凝抑制試驗(yàn)抗原（批號(hào)2021004）及陰陽(yáng)性血清，購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.2 樣品采集

家禽側(cè)臥保定，展開(kāi)翅膀，暴露翅靜脈，用酒精棉球擦拭靜脈處表皮。入針，使采血器針頭方向與靜脈一致，入針角度約為15°。緩慢抽取禽血3～5 mL，拔出針頭，套緊針帽，禽翅靜脈壓迫止血，將采血器活塞拉至最底部，掰去活塞軸，做好標(biāo)記。

1.3 雞紅細(xì)胞的采集

采集3 只健康公雞血液于抗凝管中，方法同本文“1.2”，采集時(shí)將抗凝管充分顛倒，使雞血與抗凝劑混勻，標(biāo)記備用。

1.4 禽血清樣品的制備

將裝有禽全血的采血器傾斜45°放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃靜置2 h，取出，再放入4 ℃冰箱靜置過(guò)夜，使血清充分析出。將血清轉(zhuǎn)移至無(wú)菌2 mL 離心管中，做好標(biāo)記，備用。

1.5 1%紅細(xì)胞懸液制備

向抗凝血中加入PBS，顛倒混勻以充分洗滌紅細(xì)胞，1 000 r/min 室溫離心10 min，充分吸取上清。如此洗滌3 次后，用PBS 配成體積分?jǐn)?shù)為1%的紅細(xì)胞懸液，備用。

1.6 抗體效價(jià)的測(cè)定

采用HA/HI 試驗(yàn)對(duì)禽血樣本中的禽流感病毒抗體進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)（微量法）按《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T18936—2020）進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)果按照《2022—2025 年江蘇省動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查工作方案》（蘇農(nóng)辦牧〔2022〕7 號(hào)）標(biāo)準(zhǔn)判定，即HI 抗體效價(jià)≥4 log2 為免疫合格個(gè)體，免疫合格個(gè)體數(shù)量占群體總數(shù)的70%（含）以上為免疫合格群體。

2 結(jié)果與分析

2.1 各場(chǎng)點(diǎn)禽流感疫苗免疫情況

本研究對(duì)各場(chǎng)點(diǎn)禽類別、飼養(yǎng)量、飼養(yǎng)模式、日齡及免疫情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)（表1），采集的血清樣本主要來(lái)自于雞，部分來(lái)自于鴨、鵝等水禽，所有養(yǎng)禽場(chǎng)均有H5+H7 三價(jià)滅活苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re3 株）免疫史，疫苗品牌按使用率排序依次為乾元浩、大華農(nóng)、吉林冠界和哈藥集團(tuán)。

表1 各場(chǎng)點(diǎn)基本信息

2.2 各場(chǎng)點(diǎn)禽流感抗體檢測(cè)情況

對(duì)各場(chǎng)點(diǎn)禽血清的Re-11 抗體、Re-12 抗體及H7-Re3 抗體進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)各場(chǎng)點(diǎn)的免疫合格率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。300 份禽血Re-11 抗體合格率為98.3%，Re-12 抗體合格率為97.7%，H7-Re3 抗體合格率為94.3%；各場(chǎng)點(diǎn)Re-11、Re-12 抗體合格率均在70%以上，有2 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)H7-Re3 抗體合格率不足70%。禽流感免疫抗體水平整體較高，但場(chǎng)點(diǎn)F、S 的H7-Re3 免疫效果不理想。

表2 各場(chǎng)點(diǎn)抗體合格率

2.3 各場(chǎng)點(diǎn)禽流感抗體水平分析

對(duì)各場(chǎng)點(diǎn)禽血清禽流感抗體水平進(jìn)行分析，并計(jì)算出抗體效價(jià)均值及變異系數(shù)（表3）?？傮w上各場(chǎng)點(diǎn)禽流感免疫抗體效價(jià)較高、均勻度良好，但場(chǎng)點(diǎn)F、S 的抗體效價(jià)偏低且均勻度較差。

表3 各場(chǎng)點(diǎn)禽流感抗體效價(jià)均值及變異系數(shù)

續(xù)表3

3 討 論

目前，疫苗免疫仍是我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)防止禽流感暴發(fā)的主要措施，現(xiàn)階段使用的疫苗為重組禽流感病毒H5+H7 三價(jià)滅活苗（H5N1 Re-11 株+Re-12 株，H7N9 H7-Re3 株）。為主動(dòng)監(jiān)測(cè)本地區(qū)禽流感免疫情況，本研究對(duì)來(lái)自江蘇南京19 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)的300 份禽血進(jìn)行抗體檢測(cè)并對(duì)抗體水平進(jìn)行分析[9-11]，以期為禽流感防控提供依據(jù)。

3.1 南京市禽流感免疫抗體水平整體較高

本研究中所選取的養(yǎng)禽場(chǎng)點(diǎn)在飼養(yǎng)規(guī)模上全面覆蓋了禽場(chǎng)和散戶，在養(yǎng)殖禽類別上兼顧了雞、鴨、鵝3 種主要禽類。從疫苗接種率上，所有的禽類養(yǎng)殖場(chǎng)點(diǎn)均提供了禽流感疫苗免疫信息，禽流感疫苗接種率達(dá)100%，充分反映出本地區(qū)禽流感免疫工作整體完成情況良好、各場(chǎng)點(diǎn)工作人員素質(zhì)較高。從抗體合格率看，總體上禽流感3 種抗體合格率均達(dá)90%以上，且大部分場(chǎng)點(diǎn)禽流感3 種毒株的抗體效價(jià)較高（8 log2 以上），可為禽流感Re-11株、Re-12 株及H7-Re3 株的感染提供免疫保護(hù)。從抗體均勻度看，整體上禽流感3 種抗體的變異系數(shù)均不超過(guò)0.3，表明抗體均勻度較高，達(dá)到了應(yīng)有的免疫效果。

3.2 部分場(chǎng)點(diǎn)免疫效果不理想的原因

分析發(fā)現(xiàn)，場(chǎng)點(diǎn)F 和場(chǎng)點(diǎn)S 的H7-Re3 抗體合格率不足70%，理論上不能形成有效的群體保護(hù)，且這2 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)的3 種抗體的變異系數(shù)均較高（＞30%），抗體均勻度差，具有感染風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)查詢場(chǎng)點(diǎn)信息得知，場(chǎng)點(diǎn)F 最后1 次免疫距采樣時(shí)間間隔已超過(guò)180 d，推測(cè)長(zhǎng)時(shí)間未補(bǔ)免是導(dǎo)致抗體水平下降的主要原因，可通過(guò)及時(shí)補(bǔ)免使雞群抗體恢復(fù)至高水平。場(chǎng)點(diǎn)S 主要飼養(yǎng)的禽類為鵝，該批鵝日齡較低，且采樣前21 d 才進(jìn)行禽流感疫苗的免疫，推測(cè)該鵝群抗體水平較低的主要原因是免疫與采樣的時(shí)間間隔較短，鵝群尚未產(chǎn)生足夠多的抗體，可間隔一段時(shí)間再對(duì)該鵝群進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)，若抗體水平仍較低則可能是免疫失敗，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)免。

3.3 H7 亞型與H5 亞型免疫抗體水平的比較

在本研究中，對(duì)3 種抗體合格率計(jì)算發(fā)現(xiàn)，各場(chǎng)點(diǎn)合格率不足70%的指標(biāo)均為H7-Re3 抗體。因此，本研究將所有場(chǎng)點(diǎn)的全部3 種指標(biāo)的抗體效價(jià)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并計(jì)算平均值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除有2 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)3種抗體效價(jià)均達(dá)到10 log2 外，其余場(chǎng)點(diǎn)的H7 亞型抗體水平均低于該場(chǎng)點(diǎn)H5 亞型抗體水平，占89.5%。此外，由于國(guó)標(biāo)《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936—2020）中HA/HI 試驗(yàn)所能測(cè)得的最高抗體效價(jià)為10 log2，由表3 可知許多場(chǎng)點(diǎn)的H5亞型抗體均值達(dá)10.00（即全部禽血樣本抗體效價(jià)均為10 log2），理論上H7 亞型抗體水平與H5 亞型差距更大。通過(guò)查閱疫苗說(shuō)明書(shū)，未發(fā)現(xiàn)3 種毒株在疫苗中的含量有差別，且H5+H7 滅活苗為“一針三價(jià)”，理論上不存在單獨(dú)一價(jià)免疫失敗的可能，因此推測(cè)2 種H5 亞型疫苗株之間存在交叉保護(hù)。這提示我們以后在禽流感抗體監(jiān)測(cè)時(shí)要格外注意對(duì)H7 亞型的免疫抗體水平的監(jiān)測(cè)。