趙鐘毅，閉璟珊，尹德瑋，呂蕎，吳健皓，韋正吉，鄒聯(lián)斌，蘇姣秀，汪偉，辛佳亮，彭久青，李文靜，鄭敏，胡傳活

（1.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530005；2.廣西動物疫病預防控制中心，廣西南寧 530000；3.溫州大學病毒學研究所，浙江溫州 325035；4.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川成都 611130）

牛結節(jié)性皮膚?。╨umpy skin disease，LSD）是由牛結節(jié)性皮膚病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起牛的一種急性熱性傳染病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、皮膚水腫及局部有堅硬結節(jié)塊或潰瘍[1-2]。LSDV 同綿羊痘病毒（sheeppox virus，SPPV）、山羊 痘病 毒（goatpox virus，GTPV）共同組成痘病毒科羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV）。LSD暴發(fā)流行可造成養(yǎng)牛業(yè)嚴重經(jīng)濟損失，因此被世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）列為須報告動物疫病，被我國劃定為二類動物疫病。2019年8 月，LSD 疫情在我國新疆首次暴發(fā)，隨后蔓延到其他多個地區(qū)[3]。

接種疫苗和精準診斷是有效防控LSD 的重要措施[4]。目前，我國主要通過接種GTPV 弱毒活疫苗預防LSD。由于LSDV、GTPV 和SPPV 的基因組和編碼蛋白質高度相似，在血清學上尚無法有效鑒別，因此臨床上有必要建立一種能同時檢測并有效鑒別LSDV 和CaPV 其他成員的快速檢測方法。熒光PCR 具有特異性強、靈敏度高、快速高效、操作便捷等特點，已成為實驗室廣泛使用的診斷技術。本研究針對LSDV010基因保守區(qū)域設計特異性引物及TaqMan 探針，與文獻[5]設計的CaPV068基因通用引物及探針組合，通過優(yōu)化反應體系和條件，建立了一種可同時檢測并鑒別LSDV 和CaPV 其他成員的雙重熒光定量PCR 檢測方法，以期為優(yōu)化LSDV 臨床診斷和日常監(jiān)測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒與疫苗

GTPV 疫苗（AV41 株）、痘苗病毒（vaccinia virus，VACV）天壇株，由軍事獸醫(yī)研究所病毒學及免疫學實驗室惠贈；水牛匈奴病毒（buffalo hunnivirus，BufHuV）、牛腸道病毒（bovine enteroviruses，BEV），由廣西大學動物科學技術學院預防與傳染病實驗室黃偉堅課題組惠贈；口蹄疫（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）O 型、A 型二價滅活疫苗（OHM/02 株+AKT-Ⅲ株），購自內蒙古必威安泰生物科技有限公司（批號：HAC220715）；小反芻獸疫（peste des petits ruminants virus，PPRV）活疫苗（Clone9 株），購自天康生物制藥有限公司（批號：2022004-1）；禽痘病毒（fowlpox virus，F(xiàn)WPV）疫苗（282E4株）、牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）、LSDV 陽性樣品核酸、GTPV 陽性樣品核酸、542 份臨床樣品，均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

TIANamp Virus DNA/RNA Kit（批 號：MLLTU8428），購自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit（批號：AL61653A）、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0（批 號：AK1801）、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 4.0（批號：AL61448A）、E.coliDH5α Competent Cells（批 號：AK71028A）、T-Vector pMDTM19（Simple）（批 號：AIF1958A）、PremixTaqTM（TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye）（批 號：AI81195A）、Premix ExTaqTM（Probe qPCR）（批 號：AL20582A）、dNTP Mixture（批 號：AM10727A），均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物和探針

下載GenBank 中NI-2490（AF325528.1）、Russia/Saratov/2017（MH646674.1）、China/GD01/2020（MW355944.1）、HongKong/2020（MW732649.1）等流行毒株和疫苗毒株Neethling/OBP（KX764645.1）等38 個LSDV 毒株及15 個SPPV、GTPV 毒株的全基因組序列。利用Mega 軟件進行序列分析比對，Oligo7 軟件針對LSDV010保守區(qū)域設計1 對特異性引物及TaqMan 熒光探針。根據(jù)文獻[5]，合成CaPV 通用型引物和MGB 探針（表1）。引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 病毒核酸提取

根據(jù)TIANamp Virus DNA/RNA Kit 試劑盒說明書抽提樣品中病毒總核酸，-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書將抽提的BVDV、BufHuV、BEV、FMDV 和PPRV 的RNA 反轉錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組質粒標準品制備

以抽提的LSDV 基因組為模板，應用設計的引物分別進行PCR 擴增，建立25.0 μL PCR 反應體系：PremixTaqTM12.5 μL、上游引物（10 pmol/μL）1.0 μL、下游引物（10 pmol/μL）1.0 μL、DNA 模板1.0 μL、ddH2O 9.5 μL。LSDV010-F/R 反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。CaPV068-F/R反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。分別回收純化PCR 產(chǎn)物，與T-Vector pMDTM19（Simple）載體進行連接并轉化DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落培養(yǎng)后提取質粒，將PCR 鑒定和測序正確的陽性重組質粒pLSDV-010、pCaPV-068 作為標準品，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。利用NanoDrop 分光光度儀（Thermo Fisher，USA）測定重組質粒的D260 nm/D280 nm比值和濃度，選擇比值范圍在1.8～2.0的重組質粒。根據(jù)公式將質粒標準品濃度換算成拷貝數(shù)，質?？截悢?shù)=質粒濃度×10-9× 6.02×1023/（660×質粒長度）[6]。

1.6 反應條件優(yōu)化和標準曲線建立

1.6.1 反應條件優(yōu)化 將2 對引物和探針在同一反應體系中進行雙重熒光定量PCR 擴增。采用方陣試驗分別對引物終濃度（0.10～0.25 pmol/μL）、dNTP 終濃度、探針終濃度（0.10～0.25 pmol/μL）及退火溫度（56～61 ℃）進行篩選優(yōu)化。

1.6.2 標準曲線繪制 通過拷貝數(shù)計算公式，將2 種重組質粒標準品pLSDV-010 和pCaPV-068 的拷貝數(shù)濃度均調整為1.50×1010copies/μL，并以1:1 的比例混合在一起，之后進行10 倍梯度稀釋，選擇1.50×109～1.50×101copies/μL 9 個稀 釋梯度的混合標準質粒作為模板，利用建立的雙重熒光定量PCR 反應體系繪制擴增曲線和標準曲線。

1.7 特異性試驗

以FWPV、IBRV、VACV、ORFV 的基因組DNA，BVDV、BufHuV、BEV、FMDV 和PPRV的cDNA 為模板，以LSDV、GTPV 基因組DNA為陽性對照，ddH2O 為陰性對照，應用建立的雙重熒光定量PCR 方法進行檢測，分析其特異性。

1.8 靈敏性試驗

以1.50×109～1.50×100copies/μL 10 個梯度的混合標準質粒為模板，應用建立的雙重熒光定量PCR 方法進行檢測，檢驗其靈敏性。

1.9 重復性試驗

以拷貝數(shù)濃度 為1.50×108、1.50×106、1.50×104copies/μL 的混合標準質粒為模板，應用建立的雙重熒光定量PCR 方法擴增，進行組內重復性試驗；用同樣方法在不同時間對同批次提取的重組質粒進行組間重復性試驗。通過評估組內與組間的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），評價該方法的重復性水平。

1.10 臨床樣品檢測

應用本試驗建立的雙重熒光定量PCR 方法對2017年10 月至2022年11 月在廣西各地區(qū)采集的542 份臨床樣品進行檢測。以特異性結果為判定依據(jù)，若檢測樣品僅有FAM 通道出現(xiàn)典型擴增曲線且Ct ≤35，則判定為CaPV 成員病毒核酸陽性；若檢測樣品在FAM 和VIC 通道均出現(xiàn)典型擴增曲線且Ct ≤35，判定為LSDV 核酸陽性。同時采用《牛結節(jié)性皮膚病診斷技術》（GB/T 39602—2020）[7]及WOAH 推薦[8-9]方法對上述樣品進行檢測和結果判定。比較本研究所建方法與國家標準和WOAH 推薦方法的符合率。

1.11 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，應用χ2檢驗對臨床樣品的檢測數(shù)據(jù)進行差異性比較。

2 結果

2.1 重組質粒鑒定

分別利用LSDV010-F/R 和CaPV068-F/R 對構建的重組陽性質粒pLSDV-010 和pCaPV-068 進行PCR 擴增。結果（圖1～2）顯示，目的DNA 片段分別約為96 bp 和64 bp，與預期大小相符。將陽性重組質粒測序結果與NCBI 公布的CaPV 序列進行比對分析，確認為含有目的基因片段的重組陽性質粒，表明重組質粒構建成功。

圖1 pLSDV-010 PCR 鑒定結果

圖2 pCaPV-068 PCR 鑒定結果

2.2 雙重熒光定量PCR 反應條件優(yōu)化

在優(yōu)化退火溫度、引物和探針濃度后，確定了雙重熒光定量PCR 方法的最佳反應體系（表2）。反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，40個循環(huán)，在每個循環(huán)結束時收集熒光信號。

表2 雙重熒光定量PCR 最佳反應體系

2.3 雙重熒光定量PCR 標準曲線建立

以1.50×109～1.50×101copies/μL 等9 個稀釋梯度的混合標準質粒為模板，進行雙重熒光定量PCR 擴增，得到擴增曲線和標準曲線。結果（圖3）顯示，2 種標準曲線的Ct 值和稀釋滴度對數(shù)值在1.50×109～1.50×101copies/μL拷貝數(shù)濃度范圍內具有良好的線性關系，且陰性對照未出現(xiàn)特異性擴增曲線。相應的方程斜率、相關系數(shù)（R2）和擴增效率：pLSDV-010 分別為-3.259，0.998 和102.7%；pCaPV-068 分別為-3.201，0.998 和105.3%。

圖3 雙重熒光定量PCR 的擴增曲線和標準曲線

2.4 特異性試驗

以FWPV、IBRV、VACV、ORFV 的基因組DNA，BVDV、BufHuV、BEV、FMDV 和PPRV的cDNA 為模板，以LSDV、GTPV 基因組DNA為陽性對照，ddH2O 為陰性對照，采用建立的雙重熒光定量PCR 進行特異性檢驗。結果（圖4）顯示：只有LSDV 在FAM、VIC 這2 個熒光通道產(chǎn)生陽性擴增曲線，分別對應CaPV068基因和LSDV010基因；GTPV 僅有FAM 熒光通道產(chǎn)生陽性擴增曲線，對應CaPV068基因；而其他病毒沒有產(chǎn)生擴增曲線。結果說明，建立的雙重熒光定量PCR 方法可以特異性鑒別出LSDV，并與CaPV 的其他成員做區(qū)分。

圖4 雙重熒光定量PCR 特異性試驗結果

2.5 靈敏性試驗

以1.50×109～1.5×100copies/μL 等10 個稀釋梯度的混合標準質粒為模板，用于確定雙重熒光定量PCR 的最低檢出限。結果（圖5）顯示，pLSDV-010 與pCaPV-068 的最低檢出限均為15 copies/μL，表明該方法靈敏性良好。

圖5 雙重熒光定量PCR 靈敏性試驗結果

2.6 重復性試驗

選取3 個拷貝數(shù)濃度的混合質粒（1.50×108、1.50×106、1.50×104copies/μL）評估建立的雙重熒光定量PCR檢測方法的重復性。結果（表3）顯示，2 種陽性質粒標準品的組內CV 為0.10%～1.34%，組間CV 為0.30%～1.75%，表明建立的雙重熒光定量PCR 方法具有良好的重復性。

表3 雙重熒光定量PCR 重復性試驗

2.7 臨床樣品檢測

對2017年10 月至2022年11 月在廣西各地區(qū)采集的542 份牛羊皮膚結節(jié)、鼻腔拭子、血清等臨床樣品，應用建立的雙重熒光定量PCR 方法進行檢測；同時利用《牛結節(jié)性皮膚病診斷技術》（GB/T 39602—2020）和WOAH 推薦方法對樣品進行同步檢測。結果顯示：LSDV 在皮膚結節(jié)樣品中的檢出率最高，其次是環(huán)境拭子、鼻咽拭子，而血樣品的檢出率較低（表4）；本試驗所建方法與參考的檢測方法所檢出的CaPV 樣品符合率為98.52%，LSDV 為99.63%（表5）。結果表明本試驗所建的檢測方法結果可靠，可以用于臨床樣品檢測。

表4 臨床樣品種類及其陽性率

表5 2 種檢測方法一致性結果

3 討論

LSD 自1929年在贊比亞被首次發(fā)現(xiàn)后，隨著國際貿易往來已陸續(xù)傳播至非洲南部、歐洲以及亞洲等多個地區(qū)[10-11]。2019年LSDV首次擴散到我國，2020—2021年我國多個省份以及香港和臺灣等地區(qū)已有報道[12-14]。越南、泰國等東南亞國家也陸續(xù)出現(xiàn)LSD 疫情[15-16]。目前，基于熒光PCR 技術建立LSDV 鑒別診斷方法成為各國研究熱點[17-20]。例如，Wang[20]等針對RPO30基因，建立了能鑒別LSDV、GTPV 和SPPV 的雙重實時熒光定量PCR檢測方法，可檢測到102copies/μL 的病毒DNA。

2019年起，我國批準在LSD 流行地區(qū)使用GTPV 弱毒疫苗進行免疫。本課題組在開展臨床監(jiān)測時發(fā)現(xiàn)，部分免疫動物樣本可檢出GTPV 核酸，但若使用CaPV 通用型引物和探針檢測，則可能造成誤診。因此，有必要研制一種能同時檢測并區(qū)分LSDV 和CaPV 其他成員的鑒別診斷方法。通過基因序列比對發(fā)現(xiàn)，LSDV010編碼區(qū)極為保守，并與SPPV、GTPV 的相同區(qū)域存在較大差異；而LSDV068基因與CaPV 其他成員的核苷酸同源性大于99.0%[5]?；谏鲜鼋Y果，本試驗選擇LSDV010基因設計LSDV 特異性引物和TaqMan 探針，并結合CaPV068基因的通用型引物和MGB 探針，經(jīng)過優(yōu)化各種反應條件，建立了雙重熒光定量PCR檢測方法。該方法最低檢出限為15 copies/μL，優(yōu)于Wang[20]等建立的方法。應用本試驗建立的方法檢測542 份臨床樣品，共檢出LSDV 陽性樣品23 份（4.24%）、CaPV 陽性樣品30 份（5.54%），與LSDV 和CaPV 參照方法的符合率分別為99.63%和98.52%。本試驗發(fā)現(xiàn)LSDV 在皮膚結節(jié)樣品中的檢出率最高，其次是環(huán)境拭子、鼻咽拭子，而血樣品的檢出率較低。這是因為LSD 對于皮膚組織的嗜性強以及可以持續(xù)在皮膚中維持高濃度，與El-Mandrawy等[21]研究結果一致。另外，在環(huán)境樣品中檢出LSDV，說明無論是對于個體養(yǎng)殖戶還是規(guī)模養(yǎng)殖場，環(huán)境清潔與消毒是有效防控LSD傳播的重要手段。

4 結論

本研究建立了一種可同時檢測并鑒別LSDV和CaPV 其他成員的雙重熒光定量PCR 檢測方法。該方法具有良好的特異性、靈敏性和重復性，為開展LSDV、CaPV 鑒別篩查，LSDV 精準防控及相關流行病學調查提供了快捷有效的技術手段。