張春曉，李昕甜，王娟，王苗，趙奇，王利麗，孫欣藝，侯冠欣，張志強(qiáng)

（1.河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066600；2.乳山市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東乳山 264500；3.武漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430000）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella mutocida，Pm）是一種重要的人獸共患病病原菌，可引起多種動(dòng)物多類型感染，常見有巴氏桿菌肺炎、禽霍亂、羊肺炎、豬萎縮性鼻炎、兔膿血病等。Pm 主要引起牛的呼吸系統(tǒng)疾病，是危害全球養(yǎng)牛業(yè)的病原之一[1]。莢膜分型是Pm 血清分型的主要依據(jù)。引起牛感染的Pm 以A 型和B 型為主，其中A 型主要引起牛肺炎，B 型引起牛出血性敗血癥。由于該菌血清型眾多且不同菌株間缺乏交叉保護(hù)[2]，因此疫苗的免疫效果并不確切，加之我國采用“北牛南調(diào)，西牛東運(yùn)”的肉牛育肥模式，這均給Pm 感染防控增加了難度[3]。

研究[4]表明，莢膜、脂多糖、外膜蛋白及毒素等在Pm 致病過程中發(fā)揮著重要作用，因此有效單一抗原的篩選對Pm 交叉免疫保護(hù)性疫苗的研發(fā)尤為關(guān)鍵[5]。LolA 蛋白既是細(xì)胞外膜的蛋白成分之一，同時(shí)又屬于ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白[6]。轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白不僅與細(xì)菌耐藥性相關(guān)，而且在致病性中發(fā)揮重要作用[7-8]。外膜LolA 蛋白能夠廣泛吸收菌體的內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)并不斷累積，參與藥物及底物的運(yùn)輸過程，也與大多數(shù)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白相同，與細(xì)菌的多重耐藥性有著密切的關(guān)系，還能夠作為靶點(diǎn)識別機(jī)體的免疫系統(tǒng)[9]。有研究[10]表明，Pm 的外膜蛋白可對免疫小鼠產(chǎn)生良好的交叉免疫保護(hù)作用。張宇航[11]等發(fā)現(xiàn)，豬胸膜肺炎放線桿菌的外膜LolA 蛋白具有優(yōu)良的免疫原性。因此，本研究擬利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)牛源Pm LolA 蛋白，并通過動(dòng)物模型評估該重組蛋白的免疫原性和免疫保護(hù)效果，以挖掘LolA 蛋白的疫苗潛力，為Pm 免疫保護(hù)蛋白的篩選積累技術(shù)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛源Pm、pMD18-T、pET-32a、DH5α、BL21感受態(tài)細(xì)胞，由河北科技師范學(xué)院動(dòng)物傳染病研究室提供；6～8 周齡清潔級昆明小鼠，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所；SDS-PAGE 凝膠試劑盒、Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化親和層析柱、鼠源抗His 標(biāo)簽抗體、HRP 標(biāo)記抗體（山羊抗小鼠IgG），購自北京康為世紀(jì)公司；PVDF 膜，購自美國Millipore 公司；質(zhì)粒小提試劑盒，購自O(shè)MEGA 公司。

1.2 lolA 基因克隆及序列分析

根據(jù)NCBI 登錄的Pm 參考菌株基因組序列（CP95014.1），分別設(shè)計(jì)含BamH I和SalI 酶切位點(diǎn)的上下游引物。引物P1：5'-CGGGATCCGATGCAGCAAGCGAATTACAGCAAC-3'（BamH I）；引 物P2：5'-ACGCGTCGACTTTTTGGCGTTGGTCATCGAGTTCT-3'（SalI）。

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取牛源Pm 基因組。以P1/P2 為引物，提取的基因組為模板擴(kuò)增lolA基因，并將其克隆到pMD18-T 載體上送至上海生物工程公司測序。將所測的基因序列與GenBank 中不同動(dòng)物源性Pm的lolA基因序列進(jìn)行Blast 對比，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.3 重組質(zhì)粒pET-32a-lolA 構(gòu)建

將測序正確的PmlolA基因片段與pET-32a載體同時(shí)使用BamH I和SalI 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切后連接過夜，并轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。將PCR 和雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-lolA，并送至上海生物工程公司進(jìn)行測序。

1.4 rLolA 蛋白原核表達(dá)與驗(yàn)證

參照文獻(xiàn)[12]方法，將重組質(zhì)粒pET-32a-lolA、空白質(zhì)粒pET-32a 同時(shí)轉(zhuǎn)化BL21 感受態(tài)細(xì)胞；經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)后，通過SDS-PAGE 凝膠電泳和Western blot 判斷目的蛋白的表達(dá)情況。

1.5 rLolA 蛋白可溶性分析與純化

將誘導(dǎo)培養(yǎng)的重組菌體進(jìn)行超聲破碎，通過SDS-PAGE 凝膠電泳分析目的蛋白在沉淀和上清中的表達(dá)情況，并根據(jù)結(jié)果選擇合適的蛋白純化方法；將純化后的蛋白于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 免疫小鼠血清抗體水平檢測

參照文獻(xiàn)[13]方法，取清潔級昆明小鼠20只平均分為試驗(yàn)組與對照組，以純化的rLolA 蛋白作為抗原，以50 μg/只的劑量，經(jīng)弗式完全佐劑乳化后背部多點(diǎn)注射試驗(yàn)組小鼠；2 周后和4 周后分別進(jìn)行二免和三免，后兩次免疫使用弗氏不完全佐劑乳化蛋白。對照組于相同時(shí)間點(diǎn)注射相同佐劑乳化的PBS。每次免疫前后分別從小鼠尾尖采血，分離血清于-20 ℃保存。以rLolA 重組蛋白為包被抗原，利用間接ELISA 方法檢測小鼠血清的抗體效價(jià)，以陰性血清OD450nm平均值+3SD 作為陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，繪制小鼠血清特異性抗體水平曲線。

1.7 rLolA 蛋白免疫小鼠保護(hù)試驗(yàn)

取20 只清潔級昆明小鼠平均分為試驗(yàn)組與對照組，參照1.6 的方法進(jìn)行3 次免疫。參照文獻(xiàn)[14]方法，于首免后48 d，對兩組小鼠腹腔接種2 LD50（1.64×106CFU）Pm 菌液，觀察7 d，統(tǒng)計(jì)兩組小鼠的死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 lolA 基因克隆及序列分析

利用PCR 方法擴(kuò)增完整的lolA基因片段，于618 bp 處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。將目的基因克隆到pMD18-T 載體上，經(jīng)PCR 和雙酶切鑒定出現(xiàn)一致條帶，且基因測序結(jié)果無突變移碼。系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）顯示，所測序列與不同動(dòng)物源性PmlolA基因同源性較高，說明該基因高度保守。

圖1 PCR 擴(kuò)增Pm lolA 基因結(jié)果

圖2 不同菌株lolA 基因同源性分析結(jié)果

2.2 rLolA 蛋白原核表達(dá)與驗(yàn)證

利用SDS-PAGE 凝膠電泳檢測重組蛋白，電泳結(jié)束后將分離膠放入適量考馬斯亮藍(lán)R-250 染色液中染色，染色完成后用去離子水進(jìn)行脫色處理，直至出現(xiàn)清晰條帶。重組蛋白在約40 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小一致（圖3）。進(jìn)一步以His-Tag 為一抗（1:1 000 稀釋）進(jìn)行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)目的條帶同樣出現(xiàn)在約40 ku 處（圖4），表明rLolA 蛋白表達(dá)成功。

圖3 SDS-PAGE 結(jié)果

圖4 Western blot 結(jié)果

2.3 rLolA 蛋白可溶性分析及純化

對rLolA 蛋白進(jìn)行的可溶性分析結(jié)果（圖5）顯示，重組蛋白主要表達(dá)在上清中；使用鎳離子親和層析柱純化上清液，發(fā)現(xiàn)在40 ku 處出現(xiàn)目的條帶（圖6）；使用ND-2000 超微量核酸蛋白測定儀測定的蛋白質(zhì)量濃度為1.029 2 mg/mL。

圖5 rLolA 蛋白可溶性分析結(jié)果

圖6 rLolA 蛋白純化效果

2.4 免疫小鼠血清抗體水平檢測

結(jié)果（圖7）顯示，經(jīng)兩次免疫后，試驗(yàn)組小鼠相比對照組小鼠產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，并在三免后達(dá)到最高水平，表明該重組蛋白具有良好的免疫原性。

圖7 免疫小鼠血清抗體水平變化

2.5 rLolA 蛋白免疫小鼠保護(hù)試驗(yàn)

首免后48 d，對試驗(yàn)組及對照組小鼠均以2 LD50牛源Pm 菌液進(jìn)行腹腔感染，記錄各組致死量。結(jié)果（圖8）顯示，在攻毒后3 d 內(nèi)，對照組小鼠存活率為0，而試驗(yàn)組小鼠存活率為55%，表明rLolA 蛋白具有一定的免疫保護(hù)效果。

圖8 rLolA 蛋白對小鼠的免疫保護(hù)效果

3 討論

近年來，牛呼吸系統(tǒng)疾病（BRD）嚴(yán)重阻礙著全球養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，其中Pm 是引發(fā)BRD的重要病原體之一。此外，Pm 還可引起多種動(dòng)物患病[15-16]，導(dǎo)致人患細(xì)菌性腦膜炎，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失的同時(shí)嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生安全[17-18]。因此，研發(fā)有效的Pm 疫苗尤為重要。已有研究[19]發(fā)現(xiàn)，以Pm 外膜蛋白為抗原，與相應(yīng)佐劑混合制備成疫苗，其免疫效果顯著。LolA 蛋白是外膜蛋白的重要組成部分，不僅參與調(diào)控細(xì)菌的吸附過程，在其他細(xì)菌上的免疫原性也已被證實(shí)[20]。本試驗(yàn)對不同菌株的lolA基因進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)不同動(dòng)物源性PmlolA基因同源性較高，序列高度保守。這意味著該蛋白對于其他動(dòng)物感染Pm 也可能具有良好的免疫保護(hù)效果。本試驗(yàn)選擇牛源Pm 外膜LolA 蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，進(jìn)一步獲得了純化的重組蛋白，進(jìn)而通過小鼠模型評估了rLolA 蛋白的免疫效果，證明該蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。

本試驗(yàn)借鑒前人經(jīng)驗(yàn)于首免后48 d 進(jìn)行動(dòng)物感染試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白對免疫小鼠的保護(hù)率達(dá)55%，但該蛋白的免疫持續(xù)期仍然未知；另外本試驗(yàn)只是基于抗體效價(jià)的檢測，缺少細(xì)胞免疫方面的研究，這些問題有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

通過融合蛋白的方式提高蛋白免疫特性的研究日益增多，將鞭毛蛋白作為疫苗載體蛋白或者疫苗佐劑與外膜蛋白形成融合蛋白，可顯著提高外膜蛋白的免疫原性[21-22]。LolA 蛋白是否可以通過此種方式提高免疫保護(hù)效果將是接下來的研究方向。