劉海楠，馮玉俊，郭連峰，王林娜，趙正歷

1.河北省殘疾人康復(fù)中心，河北石家莊 050081；2.衡水市人民醫(yī)院，河北衡水 053000

甲狀腺癌(TC)是頭頸部常見的惡性腫瘤，其中80%～90%為甲狀腺乳頭狀癌(PTC)，多數(shù)患者術(shù)后預(yù)后良好，但仍有30%的患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后較差[1-2]。因此，積極尋找TC病情評(píng)估及監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)參與惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展，可為臨床有效治療癌癥提供新的策略[3]。miR-1296被證實(shí)在三陰性乳腺癌中具有巨大的治療功效，且在膠質(zhì)瘤等多種癌癥中發(fā)現(xiàn)了miR-1296表達(dá)異常減少[4-5]。此外，miR-1243也是與惡性腫瘤密切相關(guān)的miRNA，具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用[6]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于miR-1296、miR-1243在TC中表達(dá)情況的研究較少，本研究重點(diǎn)探討TC癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平及其與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，初步探討二者對(duì)TC發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 經(jīng)河北省殘疾人康復(fù)中心和衡水市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，選取2020年3月至2021年3月于河北省殘疾人康復(fù)中心和衡水市人民醫(yī)院治療的85例TC患者，男33例、女52例，年齡26～75歲、平均(54.89±9.37)歲，病理類型：乳頭狀癌72例、濾泡狀癌13例，病灶數(shù)目：?jiǎn)伟l(fā)50例、多發(fā)35例，腫瘤最大徑：≤2 cm 46例、>2 cm 39例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期53例、Ⅲ～Ⅳ期32例，有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例，分化程度：低分化42例、中分化26例、高分化17例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合TC診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)首次檢出；(3)術(shù)前未進(jìn)行放化療；(4)無手術(shù)禁忌；(5)對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前已發(fā)生其他臟器轉(zhuǎn)移者；(2)合并嚴(yán)重感染或其他惡性腫瘤者；(3)精神疾病患者。

1.2儀器與試劑 RNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20191226。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購(gòu)自武漢科昊佳生物科技有限公司。miR-1296、miR-1243、U6引物均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3方法 所有患者均取術(shù)中TC癌組織及癌旁組織(癌旁2 cm)，即刻送檢，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-1296、miR-1243表達(dá)水平。取100 mg組織標(biāo)本，采用RNA提取試劑盒以Trizol法提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒說明書設(shè)計(jì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，進(jìn)行PCR，反應(yīng)步驟：95 ℃ 15 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；miR-1296正向引物為5′-ATGGACTTCCGGTCAGGTTCA-3′，反向引物為5′-GCCCTTGCCCAGTAGCTTCA-3′；miR-1243正向引物為5′-CAGGCATGGAGACGCTACTGA-3′，反向引物為5′-TCCGATCGCAGGTGACTGA-3′；以U6為內(nèi)參基因，U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。應(yīng)用公式2-ΔΔct計(jì)算miR-1296、miR-1243的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4觀察指標(biāo) (1)癌組織、癌旁組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平。(2)不同臨床病理特征(性別、年齡、病理類型、病灶數(shù)目、腫瘤最大徑、臨床分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度)患者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平。(3)隨訪1年，統(tǒng)計(jì)患者術(shù)后復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況[8]，比較復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1癌組織、癌旁組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平比較 TC患者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平均較癌旁組織低(P<0.05)，見表1。

表1 癌組織、癌旁組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平比較

2.2不同臨床病理特征患者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平比較 不同性別、年齡、病理類型、病灶數(shù)目、腫瘤最大徑、腫瘤分化程度患者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；臨床分期Ⅲ～Ⅳ期者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平較Ⅰ～Ⅱ期者低(P<0.05)，有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平較無轉(zhuǎn)移者低(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征患者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平比較

續(xù)表2 不同臨床病理特征患者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平比較

2.3miR-1296、miR-1243表達(dá)水平與TC臨床病理特征的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，TC組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平與臨床分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無=0，有=1)均呈負(fù)相關(guān)(r<0，P<0.05)，見表3。

表3 miR-1296、miR-1243表達(dá)水平與TC臨床病理特征的相關(guān)性

2.4不同預(yù)后患者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平 隨訪1年，所有患者均完成隨訪，復(fù)發(fā)14例，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移10例。復(fù)發(fā)者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平較未復(fù)發(fā)者低，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平較無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者低(P<0.05)。見表4。

表4 不同預(yù)后患者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平

續(xù)表4 不同預(yù)后患者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平

2.5miR-1296、miR-1243表達(dá)情況與TC術(shù)后復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的交互作用 以TC患者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平均值為界，分為低表達(dá)(<均值)和高表達(dá)(≥均值)。交互作用分析顯示，癌組織中miR-1296低表達(dá)、miR-1243低表達(dá)與TC術(shù)后復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中呈正向交互作用(γ=2.034、1.718，P<0.05)，且均為超相乘模型。見表5、6。

表5 癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)情況與TC術(shù)后復(fù)發(fā)的交互作用分析

表6 癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)情況與TC術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的交互作用分析

3 討 論

TC是起源于甲狀腺濾泡上皮或?yàn)V泡旁上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，細(xì)針穿刺活檢是臨床診斷TC的重要方法，但穿刺活檢結(jié)果易受腫瘤大小、位置等因素影響，導(dǎo)致部分患者不能確診[9]。越來越多的研究顯示，miRNA可作為TC診斷的標(biāo)志物[10-11]。

miR-1296是一種參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志物，如ZANG等[12]認(rèn)為miR-1296能抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。DENG等[13]研究顯示miR-1296表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后相關(guān)，并通過Wnt信號(hào)抑制細(xì)胞增殖和侵襲。但miR-1296在TC中的研究較少。本研究結(jié)果顯示，TC患者癌組織中miR-1296表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，且隨著TC患者臨床分期的增加、發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，癌組織中miR-1296表達(dá)水平降低更明顯?？梢姡┙M織中miR-1296表達(dá)水平與TC的發(fā)生有關(guān)，并參與了TC腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移。目前已知的miR-1296靶基因包括SRPK1、KEGG等，但miRNA的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)相當(dāng)復(fù)雜，miR-1296被證實(shí)與MAP17存在結(jié)合位點(diǎn)，二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其可能通過靶向調(diào)控MAP17參與TC的發(fā)生、發(fā)展[14]。而MAP17能通過降低p53的穩(wěn)定性促進(jìn)PTC的發(fā)生[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)，TC癌組織中miR-1296表達(dá)水平與臨床分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步說明miR-1296低表達(dá)與TC進(jìn)展有關(guān)。但季昳弛等[14]的研究結(jié)果顯示，癌組織中miR-1296相對(duì)表達(dá)量與PTC患者腫瘤最大徑密切相關(guān)。而本研究中不同腫瘤最大徑TC患者癌組織中miR-1296表達(dá)水平無明顯差異，與上述研究結(jié)果存在一定差異，這可能與研究對(duì)象、樣本量不同有關(guān)，仍需通過大樣本的前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，有報(bào)道指出PTC患者癌組織中miR-1243表達(dá)下調(diào)，與PTC的進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，可能具有抑癌作用，但其機(jī)制尚未明確[16]。本研究結(jié)果顯示，TC患者癌組織中miR-1243表達(dá)水平均低于癌旁組織，且TC癌組織中miR-1243表達(dá)水平與臨床分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，與上述研究結(jié)果基本一致，說明miR-1243參與TC的發(fā)生，并可能發(fā)揮抑制TC進(jìn)展的作用。miR-1243具有靶向抑制Akt1、Akt2表達(dá)的作用，而Akt1、Akt2則能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，miR-1243表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致對(duì)Akt1、Akt2的抑制作用降低，從而促進(jìn)PTC的發(fā)生發(fā)展[17-18]。但miR-1243是否能通過其他途徑調(diào)節(jié)TC的發(fā)生發(fā)展尚未可知。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)水平明顯低于未復(fù)發(fā)、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，提示癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)與TC患者預(yù)后有關(guān)。本研究進(jìn)一步分析了TC癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織中miR-1296低表達(dá)與miR-1243低表達(dá)均會(huì)明顯增加術(shù)后復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，且二者在TC術(shù)后復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中均呈超相乘模型的正向交互作用，即miR-1296與miR-1243同時(shí)低表達(dá)會(huì)增加各自對(duì)預(yù)后的作用效應(yīng)。分析其原因可能在于，miR-1296能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，其表達(dá)致使其上述抑制作用減弱，而miR-1243表達(dá)水平降低導(dǎo)致其靶向抑制Akt1、Akt2表達(dá)的作用減弱，證實(shí)Akt1、Akt2表達(dá)及活性增加，因此miR-1296與miR-1243同時(shí)低表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，增加術(shù)后復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。由此可見，采用miR技術(shù)調(diào)控癌組織中miR-1296、miR-1243表達(dá)可影響TC惡性生物學(xué)特征即預(yù)后，可為TC的靶向治療提供新思路。

綜上所述，miR-1296、miR-1243在TC癌組織中的表達(dá)明顯降低，二者表達(dá)水平與TC臨床分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，且在TC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用，可作為評(píng)估TC臨床病理特征及預(yù)后的生物標(biāo)志物。但本研究仍存在一定局限性，未探究TC患者血清中miR-1296、miR-1243水平及臨床意義，未來工作中仍需進(jìn)一步深入探討。