申 敏， 柴友榮

(1.長(zhǎng)治職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西長(zhǎng)治 046000； 2.西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶北碚 400700)

油菜在分類學(xué)上屬于十字花科蕓薹屬。油菜是一種重要的食用油原料、蛋白質(zhì)飼料和一種理想的生物柴油原料。它屬于全球最主要的油料作物之一。中國(guó)既是油菜的主要生產(chǎn)國(guó)，也是主要的消費(fèi)國(guó)。油菜是產(chǎn)油效率最高的作物之一，菜籽油是我國(guó)的傳統(tǒng)使用油，在人民生活和我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。

大量研究表明，黃籽油菜的含油量高于傳統(tǒng)的黑籽和褐籽油菜，黃籽油菜色素少，榨出的油顏色清亮，而且種皮薄、纖維素含量低、蛋白質(zhì)含量高、菜籽油富含多酚且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，所以培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃籽品種是油菜育種界的目標(biāo)[1]。油菜籽經(jīng)壓榨后，餅粕與食用油分離，餅粕中的大量蛋白質(zhì)作為飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高。近年來世界性能源危機(jī)，導(dǎo)致工業(yè)用油非常緊張，油菜生產(chǎn)為其提供了新的解決思路[2]。

甘藍(lán)型黃籽油菜遺傳背景復(fù)雜，較難穩(wěn)定遺傳，且目前沒有天然油菜黃籽突變體。迄今為止，關(guān)于甘藍(lán)型油菜種皮色澤在分子層面的研究報(bào)道并不多見[3]，對(duì)種皮顏色合成機(jī)理還沒有統(tǒng)一看法。類黃酮代謝是植物次生代謝中最廣泛的次生代謝途徑之一，絕大多數(shù)植物中含有類黃酮化合物。類黃酮主要在植物生長(zhǎng)、發(fā)育以及抗生理逆境等方面起重要作用[4]。植物器官表面顏色主要成分是原花青素、花青素與黃酮醇。擬南芥是甘藍(lán)型油菜的模式植物，據(jù)報(bào)道由于擬南芥中一些基因突變，導(dǎo)致種皮色素核心成分原花青素下降，種皮呈現(xiàn)透明或半透明[5]。這種由于種皮中原花青素含量的下降導(dǎo)致種皮呈現(xiàn)種胚顏色的突變，被稱為透明種皮突變。

RNA干擾是指外援或內(nèi)源性的雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后引起同源RNA特異性降解的現(xiàn)象，表現(xiàn)為特定基因的缺失。這在生物體內(nèi)是一種普遍存在的生理機(jī)制。在后基因時(shí)代，RNA干擾正在成為一個(gè)非常有效的基因功能研究工具[6]，具有特異性高、穩(wěn)定性高、效性高、可穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)。目前主要用于植物的性狀改良等方面。

擬南芥中TT2基因編碼MYB蛋白，主要參與調(diào)控類黃酮代謝途徑后期結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，如BAN、DFR，從而達(dá)到調(diào)控種皮原花青素、花青素苷的積累。擬南芥tt2突變體種子顯示透明種皮性狀，即黃籽性狀[7]。擬南芥與甘藍(lán)型油菜同屬十字花科蕓薹屬植物，兩者基因組序列保守性非常高，許多基因功能極為相似。因此，對(duì)甘藍(lán)型油菜TT2基因進(jìn)行功能鑒定，是篩選黃籽油菜位點(diǎn)的重要途徑，可為推動(dòng)甘藍(lán)型黃籽油菜育種進(jìn)程，以及研究甘藍(lán)型黃籽油菜種皮色澤穩(wěn)定遺傳提供理論基礎(chǔ)[8]。隨著人們對(duì)油菜基因組學(xué)研究的深入和RNAi技術(shù)的不斷完善，RNAi在黃籽油菜的育種應(yīng)用中前景更加廣闊，同時(shí)也為黃籽油菜育種帶來更大的科研價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，有助于揭示蕓薹屬種皮色素合成機(jī)理，加速分子育種的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所采用的植物材料為中雙10號(hào)油菜種，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404、植物RNA干擾平臺(tái)載體為筆者所在課題組改造而成，改良型植物載體由本課題組提供，克隆載體等購自TaKaRa公司。

PCR儀、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、紫外與可見分析裝置等。

EasyTaq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、DL-2000 plus DNA marker，植物DNA抽提試劑盒；植物RNA抽提試劑盒(小量)；反轉(zhuǎn)錄PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 甘藍(lán)型油菜TT2基因RNA干擾 發(fā)苗：無菌條件下種子清水浸泡培養(yǎng)6～8 d的幼苗用于預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)：將10 cm左右的幼苗切為 0.5 cm 長(zhǎng)的下胚軸切段，于培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)48～72 h。農(nóng)桿菌侵染：暗培養(yǎng)約2 d→轉(zhuǎn)接1次(1/100體積接種量)→二次培養(yǎng)，培養(yǎng)至D600 nm=0.8～1.0左右(約6～8 h)，將外植體轉(zhuǎn)接于鋪有無菌濾紙的共培養(yǎng)基上。共培養(yǎng)：接種完成后暗培養(yǎng)48 h。

共培養(yǎng)后的外植體浸殺農(nóng)桿菌后于誘導(dǎo)抗性愈傷中光培養(yǎng)14 d以上，至長(zhǎng)出肉眼可見的抗性愈傷。誘導(dǎo)出肉眼可見抗性愈傷的外植體轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上，根據(jù)構(gòu)建載體中抗生素篩選壓不同設(shè)計(jì)甘藍(lán)型油菜TT2RNA干擾分化培養(yǎng)基。待外植體分化出莖后轉(zhuǎn)接繼代培養(yǎng)，光照培養(yǎng)直至分化長(zhǎng)出較長(zhǎng)的莖與葉片。再將分化出莖與葉的幼苗繼代于分化根培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)至長(zhǎng)出5～7條主根為止。最后水培馴化及移栽在馴化室。

1.2.1 轉(zhuǎn)基因陽性植株獲得 因載體構(gòu)建時(shí)加入抗Basta基因，將濃度為 200 mg/L 的Basta溶液均勻涂抹于再生植株嫩葉表面，48～72 h后觀察葉片的變化情況，以及再生植株是否具有Basta抗性。用DNA小量抽提試劑盒提取再生植株的基因組總DNA，經(jīng)電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量，確保所提DNA能滿足PCR擴(kuò)增的要求。采用TT2基因特異引物組合F35S3N+FBTT2I，以再生植株的DNA基因組為模板檢測(cè)RNA干擾轉(zhuǎn)化得到的再生植株是否為轉(zhuǎn)基因陽性植株。

檢測(cè)程序：再生苗檢測(cè)引物(F35S3N，F(xiàn)BTT2I)94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性 45 s，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸 10 min，16 ℃ 10 min。

1.2.3 再生植株T1種籽粒色性狀考察和千粒質(zhì)量的測(cè)定 在體視顯微鏡下轉(zhuǎn)基因陽性種子與陰性種子一同拍照。收獲后的T1代種子脫粒去雜質(zhì)后獲得1 000粒種子，然后稱質(zhì)量。不足1 000粒的樣本，求平均值后乘以1 000得到千粒質(zhì)量。

1.2.4 種子切片觀察 使用低溫冷凍切片機(jī)將轉(zhuǎn)基因陽性種子切為 5 mm 薄片，在熒光顯微鏡下觀察測(cè)量種皮厚度。

1.2.5 木質(zhì)素含量測(cè)定 木質(zhì)素含量測(cè)定參照Morrison的方法[9]，略有更改。稱取干燥后種皮 1.0 g，加入95%乙醇中勻漿，上離心機(jī)離心后將沉淀物用95%乙醇沖洗3次，再使用乙醇、正己烷配比后的混合液沖洗3次后，使其緩慢干燥。取干燥后材料0.10 g，溶于0.5 mL 25%溴乙酰冰醋酸溶液中，高溫恒溫水浴一段時(shí)間。加NaOH終止反應(yīng)。再加入冰醋酸和羥胺鹽酸，使用冰醋酸作為定容液定容至10 mL，多次離心后取上清液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度D值。按回歸方程y=0.086 3x+0.088計(jì)算種皮中木質(zhì)素的含量，其中，y為280 nm下的D值，x為種皮木質(zhì)素的百分含量[10]。

1.2.6 原花青素含量測(cè)定 原花青素含量采用香草醛-鹽酸法測(cè)定：(1)配制顯色試劑：A為1%香草醛，B為8%鹽酸溶液，顯色液為A ∶B=1 ∶1?，F(xiàn)用現(xiàn)配。(2)提取物中原花青素含量的測(cè)定：種皮勻漿粉碎后，用70%乙醇反復(fù)沖洗提取后離心獲得上清液定容，從定容液中取1 mL顯色分析。(3)分光光度劑測(cè)定原花青素含量：取樣液1 mL，加入顯色劑5 mL，搖勻避光放置，在低溫水浴鍋中水浴 30 min，取出在500 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品中原花青素的含量。(4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙醇溶解原花青素標(biāo)樣，濃度為0.6 mg/mL，分別取1、2、3、4、5 mL，定容至10 mL，分別從定容液中取 1 mL 加入5 mL顯色劑。同樣在低溫水浴后測(cè)得吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。(5)計(jì)算原花青素百分含量[11]。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因植株基因表達(dá)分析

1.2.7.1 RNA提取、純化及反轉(zhuǎn)錄 使用華舜公司的植物組織RNA抽提試劑盒，要求提取再生陽性植株的總RNA貯存于-80 ℃。

根據(jù)試劑盒指導(dǎo)將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?7 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；放于-20 ℃保存或者直接檢測(cè)cDNA質(zhì)量。

1.2.7.2 定量Q-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株TT2基因抑制水平 分別以野生型甘藍(lán)型油菜和陽性轉(zhuǎn)基因油菜的cDNA為模板，同時(shí)采用定量PCR法以引物組合(FBnTT2A，RBnTT2A)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因中TT2基因的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA干擾材料獲得

使用濃度為200 mg/L Basta溶液分別涂抹于再生植株嫩葉表面進(jìn)行抗Basta篩選，48～72 h后觀察葉片的變化。轉(zhuǎn)基因植株中載體片段含Basta抗性基因，植株嫩葉有損傷但可自愈；野生植株葉片完全不抗Basta，葉片出現(xiàn)枯萎死亡(圖1)。初步篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)再生植株進(jìn)行PCR 陽性鑒定，擴(kuò)增條帶為466 bp，與目標(biāo)條帶一致(圖2)，共篩選到25株陽性轉(zhuǎn)基因苗。

2.2 轉(zhuǎn)基因材料表型鑒定

通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株種皮顏色變淺，呈現(xiàn)紅棕色或紅褐色(圖3)。表明RNA干擾抑制種皮色素合成，色素積累減少，推測(cè)種皮中類黃酮代謝途徑基因表達(dá)抑制。通過對(duì)比還發(fā)現(xiàn)，種子個(gè)體明顯變小，千粒質(zhì)量下降，結(jié)實(shí)率降低。轉(zhuǎn)基因陽性植株千粒質(zhì)量 (2.332 g)比野生型植株(2.910 g)平均低0.578 g。陽性植株結(jié)實(shí)率(37.92%)比野生型植株(54.4%)低16.48百分點(diǎn)。表明RNA干擾技術(shù)可能影響種子內(nèi)容物積累，影響種子結(jié)實(shí)率與千粒質(zhì)量。

2.3 種子冷凍切片

為研究RNA干擾TT2基因?qū)ΨN皮的影響，對(duì)轉(zhuǎn)基因陽性植株收獲種子進(jìn)行石蠟冷凍切片。熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因RNA干擾陽性苗種皮厚度明顯降低，柵欄組織稀疏。陽性植株種皮厚度均值(44.56 μm)比野生型植株種皮厚度(45.77 μm)低1.21 μm(圖4)。表明RNA干擾技術(shù)影響種皮厚度，對(duì)柵欄層組織形成有影響。

2.4 木質(zhì)素含量分析

由表1可知，轉(zhuǎn)基因材料種皮木質(zhì)素含量均值(16.35%)比野生型材料(20.42%)低4.07百分點(diǎn)。表明沉默TT2基因會(huì)影響種子種皮中木質(zhì)素含量。苯丙烷途徑包括類黃酮途徑和木質(zhì)素代謝途徑，TT2的缺失可能影響到木質(zhì)素代謝途徑中下游靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響種皮中木質(zhì)素的含量。

表1 木質(zhì)素含量測(cè)定

2.5 原花青素含量分析

由表2可知，轉(zhuǎn)基因植株種皮原花青素含量均值(5.47%)比野生型植株原花青素含量(7.42%)低1.95百分點(diǎn)?；ㄇ嗨靥禺愋苑e累在內(nèi)種皮，擬南芥研究表明，AtTTG2基因功能失活后會(huì)導(dǎo)致擬南芥種皮由野生型的深褐色種子轉(zhuǎn)變?yōu)橥该鞣N皮(黃籽)。TT2、TT8、TTG1這3個(gè)轉(zhuǎn)錄子共同調(diào)控幼種中幾個(gè)類黃酮結(jié)構(gòu)基因在內(nèi)種皮的表達(dá)。這與前面的種皮顏色考察結(jié)論一致，進(jìn)一步證明RNA干擾沉默TT2基因影響種皮色素合成。

表2 原花青素含量測(cè)定

2.6 TT2基因組織表達(dá)特異性分析

甘藍(lán)型油菜TT2基因在油菜幼種中特異性表達(dá)，取花后15 d的幼種，提取RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用熒光定量PCR檢測(cè)TT2基因表達(dá)情況。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TT2基因表達(dá)結(jié)果(圖5)顯示，轉(zhuǎn)基因陽性植株TT2基因整體表達(dá)下調(diào)，在個(gè)別陽性植株內(nèi)出現(xiàn)TT2基因表達(dá)接近沉默。表明RNA干擾技術(shù)可以作為一種有效抑制或關(guān)閉目標(biāo)基因的沉默技術(shù)。

3 討論

TT2基因編碼R2R3-MYB蛋白，是調(diào)控發(fā)育中種子原花青素積累的關(guān)鍵因子，種子特異表達(dá)，轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)在內(nèi)皮層，主要影響種皮色素沉積和種坯發(fā)育[10]，決定類黃酮生物合成酶BAN基因的正確表達(dá)，影響原花青素生物合成與轉(zhuǎn)運(yùn)。

本研究采用基因沉默方法，RNAi是由雙鏈RNA介導(dǎo)的特異基因沉默現(xiàn)象，是一種轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默技術(shù)，相對(duì)于反義和共抑制技術(shù)，沉默效率更高。RNA干擾引發(fā)mRNA降解，這種方法可用做于開啟或關(guān)閉目標(biāo)基因。在擬南芥與水稻這些模式植物中，RNA干擾技術(shù)被用來研究基因功能和產(chǎn)生新的表型[10]。干擾片段在300～500 bp之間的干擾效果最好[11]，甘藍(lán)型油菜中TT2基因片段為466 bp。RNAi效率比反義RNA高得多，且穩(wěn)定性好。植物界基因家族干擾現(xiàn)象很普遍[12-13]，RNAi既可用于對(duì)不同成員進(jìn)行分別沉默，也可用于對(duì)整個(gè)家族進(jìn)行有效沉默。

本研究使用課題組構(gòu)建好的工程菌株轉(zhuǎn)化中雙10號(hào)，得到轉(zhuǎn)基因陽性植株。在轉(zhuǎn)化過程中培養(yǎng)基2周更換1次[14]，可以縮短遺傳轉(zhuǎn)化周期，減少有毒代謝物質(zhì)的積累，防止抗生素篩選壓失效，減少假陽性苗出現(xiàn)[15]。

本研究表明，RNAi基因沉默TT2基因，導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜種皮顏色變淺，種子變小，飽滿度減少，結(jié)實(shí)率降低。分子層面上抑制TT2基因的表達(dá)，甚至直接關(guān)閉目標(biāo)基因表達(dá)。種皮切片顯示，所有轉(zhuǎn)基因陽性植株種皮變薄，柵欄組織疏松，這與TT2基因在種子內(nèi)種皮特異性表達(dá)預(yù)測(cè)結(jié)果[16-17]一致。種皮原花青素含量降低，說明TT2基因缺失導(dǎo)致種皮中色素積累減少，顏色變淺。木質(zhì)素含量降低，表明木質(zhì)素代謝途徑作為苯丙烷通路的分支受到TT2基因缺失的影響[18]，可能與TT2基因調(diào)控的下游靶基因關(guān)閉有關(guān)[19]。這與黃籽與黑籽油菜的區(qū)別相一致。

原花青素是油菜種皮黑褐色色素的主要成分，種皮色素越少，種皮顏色更透明，油菜籽初榨油品質(zhì)更好，色澤更清澈[20]。菜籽餅中色素越低，木質(zhì)素含量越低，抗?fàn)I養(yǎng)劑就越少，菜籽油和餅粕的經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高。餅粕蛋白質(zhì)含量越高，營(yíng)養(yǎng)成分越容易被動(dòng)物吸收，為動(dòng)物成長(zhǎng)提供更多的能量。目前世界能源緊張，黃籽油菜高產(chǎn)油量可以提供生物柴油緩解能源危機(jī)。通過現(xiàn)代基因工程方法抑制油菜種皮色素積累，阻斷類黃酮代謝途徑，得到低木質(zhì)素、低纖維素、低種皮色素和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定遺傳的黃籽油菜，具有較高的研究?jī)r(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。RNA干擾作為植物功能基因組研究與發(fā)展是一種非常有潛力的技術(shù)。構(gòu)建特異RNA干擾載體沉默甘藍(lán)型油菜種皮色素基因表達(dá)為加快黃籽油菜的分子育種進(jìn)程提供依據(jù)[21]，將來可更多運(yùn)用在一些物種提高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、綜合品質(zhì)和抗病抗蟲等方面。