張西英，劉江娜，李榮霞,薛麗萍，白云鳳，張愛萍

(新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán) 第六師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆五家渠 831300)

新疆是中國(guó)主要的加工番茄種植基地，其機(jī)械采收已達(dá)到70%以上。由于番茄果實(shí)易過熟軟化，致使耐壓性能變差、抗病原菌能力降低，已嚴(yán)重影響到生產(chǎn)、貯運(yùn)及加工品質(zhì)[1]。培育抗軟化、耐貯運(yùn)的番茄新品種對(duì)新疆加工番茄的種植及加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

利用常規(guī)育種方法改良番茄品種周期長(zhǎng)，易受不良基因連鎖和種間生殖隔離的限制[2]。近年來，以多種新型高效的DNA靶向內(nèi)切酶為基礎(chǔ)建立的基因組編輯技術(shù)(Voytas，2013)，可以在不同物種中對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除、單核苷酸或多核苷酸片段置換、添加等靶向修飾，不必通過導(dǎo)入反義基因或RNAi基因抑制靶基因功能[3-6]。在各種基因編輯技術(shù)中，CRISPR/Cas9技術(shù)操作較為簡(jiǎn)單、高效，應(yīng)用更為廣泛[7-10]，CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行精確的原位編輯后，不必再通過轉(zhuǎn)基因調(diào)控目標(biāo)基因功能，而由于sgRNA-Cas9基因的整合位點(diǎn)和編輯位點(diǎn)是分離的，因此可通過自交分離剔除sgRNA-Cas9基因，獲得無轉(zhuǎn)基因序列的新種質(zhì)，比常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全可靠。基因編輯修飾的基因只有少數(shù)核苷酸改變，與自然突變或人工理化誘變本質(zhì)相同，而在效率和可控性方面則遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于誘變育種[11]。

番茄基因組較小，已完成了全基因組精細(xì)序列分析，為通過全基因組層面掃描、篩選出高特異性 sgRNA 以規(guī)避脫靶效應(yīng)提供了可靠的基因組序列和遺傳背景，且遺傳轉(zhuǎn)化體系也已成熟。迄今利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)改良番茄農(nóng)藝性狀的報(bào)道較少。番茄是二倍體自花授粉作物，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)原位定點(diǎn)修飾乙烯代謝相關(guān)基因以遲滯番茄過熟腐爛，并通過自交分離剔除外源DNA序列，獲得無轉(zhuǎn)基因序列的耐貯運(yùn)新種質(zhì)，為加工番茄新品種培育和功能基因研究提供技術(shù)支撐，也將為利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)改良番茄其他農(nóng)藝性狀做出有益探索。

1 材料與方法

1.1 材 料

番茄品種為‘新番72號(hào)’，由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第六師農(nóng)科所番茄課題組選育提供。母本‘A-10’ 是從‘里格爾87-5’中篩選出綜合抗性好的株系，經(jīng)過8代自交提純得到的穩(wěn)定材料，屬早熟加工番茄品種；父本‘MG-01’是從國(guó)外引進(jìn)的加工番茄材料‘JQ-23’，經(jīng)7代分離、純化得到的穩(wěn)定、早熟品系，以番茄的下胚軸和子葉為外植體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。

1.2 方 法

番茄為呼吸躍變型果實(shí)，伴隨呼吸躍變產(chǎn)生大量乙烯，即系統(tǒng)Ⅱ乙烯，易使番茄果實(shí)過熟，腐爛變質(zhì)。1-氨基環(huán)丙烷1-羧酸ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid)是合成乙烯的直接前體，ACC合酶ACS(ACCsynthase)是乙烯合成的限速酶，由多基因家族編碼，SlACS1和SlACS6等主導(dǎo)系統(tǒng)I乙烯的合成，SlACS2和SlACS4主導(dǎo)系統(tǒng)Ⅱ乙烯的合成。利用多種信息學(xué)工具從SlACS2基因上游的編碼區(qū)篩選出高特異性sgRNA，通過CRISPR-Cas9基因組編輯系統(tǒng)僅對(duì)SlACS2基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，調(diào)控系統(tǒng)Ⅱ乙烯過量表達(dá)，而不影響SlACS家族其他基因序列，以保證番茄正常生長(zhǎng)發(fā)育，又適度抑制系統(tǒng)Ⅱ乙烯的生成，以期遲滯番茄過熟腐爛。

1.2.1 SlACS2sgRNA的設(shè)計(jì)和選擇 克隆待改良加工番茄品種‘新番72號(hào)’等的SlACS2基因cDNA，以此作query進(jìn)行BLAST，確定SlACS2的基因組結(jié)構(gòu)以及外顯子所在染色體位置，規(guī)避設(shè)計(jì)的sgRNA被內(nèi)含子相隔而成為無效sgRNA。根據(jù)CRISPR-Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，利用CRISPRdirect篩選SlACS2第1、2外顯子區(qū)域的sgRNA序列，sgRNA的結(jié)構(gòu)設(shè)定為5′-(N)20NGG-3′，N為任意核苷酸。利用CRISPR-P驗(yàn)證sgRNA的靶向特異性，篩選出靶向特異性好的sgRNA。

1.2.2 突變株的獲得和突變類型的研究 以番茄的下胚軸和子葉為外植體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，抗性篩選和分子檢測(cè)獲得T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株，然后篩選獲得T0代突變植株自交結(jié)實(shí)后得到的T1代種子，將T1代種子播種成苗后提取葉片基因組DNA特異性引物檢測(cè)，確定突變類型，并篩選純合突變植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于RNA-seq的 SlACS2數(shù)字表達(dá)譜

以番茄功能基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://ted.Bti.ornell.edu/cgi-bin/)中 RNA-seq data 的數(shù)據(jù)作基礎(chǔ)，建立SlACS2基因的基于 RNA-seq 的數(shù)字表達(dá)譜(圖1)。

1.子房;2.半綠果實(shí);3.成熟綠果實(shí);4.破色期果實(shí);5.成熟紅果實(shí);6.0～3 mm花蕾;7.3～8 mm花蕾;8.8 mm開花前花蕾;9.完全展開花;10.發(fā)育階段花的混合物;11.野生番茄花粉;12.感染假單胞菌葉片;13.假單胞菌葉片;14.混合誘導(dǎo)葉片;15.4～6周齡植株的頂端分生組織;16.8周齡植株頂端分生組織;17.花前根;18.掛果期根;19.營(yíng)養(yǎng)匱乏的根;20.完全吸漲5 d后的胚根;21.完全吸漲7 d后的幼苗;22.休眠種子;23.愈傷組織；PRKM.每百萬reads中來自于特定基因每千堿基長(zhǎng)度的reads數(shù)

結(jié)果顯示：SlACS2在番茄的子房、愈傷組織中有低水平表達(dá)，在破色期果實(shí)、成熟的紅果實(shí)中有較高水平的表達(dá)。證實(shí)了SlACS2是與果實(shí)成熟相關(guān)的基因，利用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行原位編輯，可能會(huì)減緩番茄內(nèi)源乙烯的產(chǎn)生，遲滯番茄過熟，提高儲(chǔ)運(yùn)品質(zhì)。

2.2 同源克隆新疆番茄 ACS2基因

以 cDNA 為模板，在 NCBI 上對(duì)序列進(jìn)行查找和分析，設(shè)計(jì)引物，如表1所示，進(jìn)行ACS2基因序列的擴(kuò)增。

表1 目的基因擴(kuò)增引物

擴(kuò)增后對(duì)目的基因進(jìn)行回收與純化。先對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下含有目的片段的凝膠，用 DNA 凝膠回收盒回收測(cè)序。利用DNAman進(jìn)行序列比對(duì)，克隆基因與NM_001247249.2完全一致，見圖2。同時(shí)，新疆番茄a(bǔ)cs2基因的cds及編輯位點(diǎn)見圖3。

圖2 DNAman序列比對(duì)結(jié)果

圖3 新疆番茄 acs2基因的cds及編輯位點(diǎn)

2.3 SlACS2染色體定位和基因組結(jié)構(gòu)

以SlACS2的cds作query，對(duì)NCBI番茄基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast，結(jié)果表明，由圖4可知，SlACSgDNA位于番茄的1號(hào)染色體(GenBankAccession:NC_015438.2)，位置在 884 560 11～884 534 90 nt之間，長(zhǎng)度2 522 nt，由4個(gè)外顯子、3個(gè)內(nèi)含子組成，前3個(gè)外顯子較短，位于SlACS2的5′端，可在每個(gè)外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)sgRNA，規(guī)避sgRNA分布在外顯子和內(nèi)含子連接處。

圖4 SlACS2染色體定位和基因組結(jié)構(gòu)

2.4 sgRNA的設(shè)計(jì)和選擇

根據(jù)CRISPR-Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則，利用CRISPRdirect(https://crispr.dbcls.jp/)篩選SlACS2外顯子區(qū)域的sgRNA序列，即3′端有PAM元件的20個(gè)連續(xù)的堿基序列，PAM元件設(shè)定為NGG，sgRNA的結(jié)構(gòu)為5′-(N)20NGG-3′，N為任意核苷酸。利用CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)對(duì)sgRNA的靶向特異性進(jìn)行綜合評(píng)分，由表2、3可知，綜合得分在 29～49。

根據(jù)CRISPRdirect在線分析，由表2可見，在第1外顯子的sgRNA中，有9條含有連續(xù)的TTTT序列，可排除。sgRNA1-2的GC含量低，sgRNA1-7在5號(hào)染色體上也有完全匹配的序列，易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。在剩余7條sgRNA中，位于外顯子132～154 nt的sgRNA1-14特異性最好，該sgRNA和它包含的對(duì)特異性起重要作用的、鄰近PAM的12 nt種子序列在番茄基因組上都是唯一序列，沒有與之完全匹配的序列。sgRNA1-14的GC含量較高，靶向特異性綜合得分也較高，可為優(yōu)選sgRNA。由表3可見，第2外顯子有9條sgRNA序列，其GC含量均低于35%，臨近PAM12nt的種子序列的脫靶位點(diǎn)在2個(gè)以上，沒有合適的sgRNA可以選擇。

表2 SIACS2基因第1外顯子含有的sgRNAs

表3 SIACS2基因第2外顯子含有的sgRNAs

2.5 番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

對(duì)加工番茄‘新番72號(hào)’的種子消毒處理后置于1/2培養(yǎng)基上發(fā)芽，獲得無菌苗。通過苗齡、外植體對(duì)番茄愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)的影響和不同激素濃度配比對(duì)愈傷組織和芽分化誘導(dǎo)的影響，最終篩選建立了無菌苗快繁再生體系(圖5)。

圖5 番茄無菌苗

通過對(duì)農(nóng)桿菌濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等方面對(duì)番茄遺傳轉(zhuǎn)化率的影響進(jìn)行研究，篩選出適宜的轉(zhuǎn)化條件。最終通過多次篩選試驗(yàn)，確定了農(nóng)桿菌OD600為0.6～0.8為宜，以0.7最佳，預(yù)培養(yǎng)2 d，侵染時(shí)間為15 min，侵染后暗培養(yǎng)一夜的最佳轉(zhuǎn)化條件(圖6)。

圖6 番茄遺傳轉(zhuǎn)化再生植株

將與農(nóng)桿菌共侵染后的愈傷組織分別放入含有 Kan的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行初步篩選培養(yǎng)，在篩選過程中，首先用20 mg/L Kan的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后，轉(zhuǎn)接至40 mg/L Kan篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d，最終在60 mg/L Kan篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，這樣即能保證轉(zhuǎn)化的愈傷組織正常分化，分化出的抗性不定芽生長(zhǎng)正常，也可減少逃逸芽的產(chǎn)生(圖7)。

圖7 抗性篩選

2.6 Cas9轉(zhuǎn)基因番茄再生植株的PCR檢測(cè)及編輯植株分子鑒定

以質(zhì)粒pSlACS2-DsgRNA為陽性對(duì)照，以野生型加工番茄‘新番72號(hào)’為陰性對(duì)照，利用CTAB法提取T0代植株的DNA，通過表4中的篩選引物，對(duì)獲得的21個(gè)抗性再生植株以Cas9特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)是否將CAS9系統(tǒng)成功轉(zhuǎn)入，其中7株擴(kuò)增出了大小為 841 bp 的目的條帶，與陽性對(duì)照一致，未轉(zhuǎn)化的野生植株未擴(kuò)增出目的條帶，見圖8，初步表明基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)化受體基因組中。PCR 擴(kuò)增體系為：基因組 DNA 1 μL，PremixTaqDNA 聚合酶 Mix 10 μL，前后引物各 0.8 μL，加雙蒸水至 20 μL；PCR 擴(kuò)增條件分別為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，PCR 產(chǎn)物的大小通過 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳得到。

M.DL2000 DNA Marker; +.陽性質(zhì)粒; WT(-).陰性對(duì)照; 1～4.轉(zhuǎn)基因抗性植株

表4 篩選PCR引物

2.7 SlACS2基因編輯植株的初步分子鑒定

將收獲的T0代突變株自交結(jié)實(shí)的T1代種子播種于大田中，提取溫室內(nèi)T1代植株DNA，利用表5中的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用靶位點(diǎn)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序及比對(duì)分析，確定編輯突變體的突變類型，并篩選純合突變單株。目前試驗(yàn)共完成394份植株的測(cè)序工作，從中篩選出無T-DNA的突變株6個(gè)，根據(jù)測(cè)序結(jié)果明確了不同植株的突變類型，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行歸納總結(jié)，其中357個(gè)植株發(fā)生突變，突變率為 90.6%，純合突變率為36.8%。

表5 篩選PCR引物

通過調(diào)查得到種子萌發(fā)率、苗期生長(zhǎng)情況及采摘期果實(shí)發(fā)育情況等相關(guān)指標(biāo)，初步明確不同突變類型會(huì)對(duì)加工番茄生長(zhǎng)和果實(shí)發(fā)育產(chǎn)生影響，同一突變類型表現(xiàn)型也不盡相同。由圖9可見，以SgRNA2處缺失7個(gè)堿基的突變類型為例，在統(tǒng)計(jì)過程中發(fā)現(xiàn)，株型多數(shù)發(fā)育不正常，表現(xiàn)為株型小葉片卷曲，果實(shí)發(fā)育也不正常，果型小多為裂果，但也有少數(shù)植株生長(zhǎng)發(fā)育正常，果型正常結(jié)果多、成熟好。

圖9 SgRNA2處缺失7個(gè)堿基

3 討論與結(jié)論

果實(shí)過熟導(dǎo)致軟化腐爛是影響新疆加工番茄種植貯運(yùn)及加工品質(zhì)的重要限制因素。而常規(guī)雜交育種改良周期長(zhǎng)，可利用的種質(zhì)資源有限；理化誘變難以控制突變方向，突變位點(diǎn)鑒定困難；常規(guī)基因工程易使民眾產(chǎn)生安全性疑慮等諸多限制因素[12-14]。通過CRISPR-Cas9這一新型基因組定點(diǎn)編輯系統(tǒng)用于番茄耐貯性能改良，通過對(duì)SlACS2基因特定位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)修飾，同時(shí)不影響SlACS基因其他家族基因序列，遲滯果實(shí)過熟軟化，提高耐貯運(yùn)性能，從根本上解決加工番茄貯藏時(shí)間短、不耐運(yùn)輸、嚴(yán)重影響加工品質(zhì)等諸多問題；利用Cas9基因整合位點(diǎn)和編輯位點(diǎn)相互獨(dú)立的特點(diǎn)，通過遺傳分離，剔出T-DNA序列，獲得無轉(zhuǎn)基因組分的耐貯運(yùn)新種質(zhì)。這一技術(shù)較雜交育種周期短，較誘變育種定向性好，較常規(guī)基因工程安全性高，將為加工番茄的遺傳改良建立一個(gè)高效安全的技術(shù)體系。

番茄是植物學(xué)研究的經(jīng)典模式系統(tǒng)之一，已經(jīng)完成了全基因組精細(xì)序列分析，通過突變體揭示基因功能成為重要研究?jī)?nèi)容[15-18]。建立加工番茄有效的基因敲除技術(shù)體系，可促進(jìn)其基因功能的研究發(fā)展，完善加工番茄CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)將為加工番茄基因功能研究、改良其他農(nóng)藝性狀、培育新品種提供新的平臺(tái)和技術(shù)支撐，具有較大的應(yīng)用前景。