楊陽陽，毛仁燕，李永才，畢 陽，蔣倩倩，謝鵬東，袁 晶

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070)

梨果黑斑病菌互隔交鏈孢(Alternariaalternata)是一種典型的潛伏侵染菌，當(dāng)其孢子接觸到梨果表面，感知表皮信號如疏水、蠟質(zhì)等的刺激后，孢子萌發(fā)并進(jìn)一步分化形成侵染結(jié)構(gòu)，進(jìn)而啟動侵染[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)G蛋白介導(dǎo)的信號級聯(lián)途徑、cAMP-PKA途徑、MAPK信號途徑和Ca2+信號途徑等主要信號通路對病原物感知外界信號進(jìn)而啟動侵染具有重要的調(diào)控作用[3-4]。其中，Ca2+信號途徑是真核生物重要的細(xì)胞傳導(dǎo)途徑之一，Ca2+被認(rèn)為是許多生物細(xì)胞生長和發(fā)育必不可少的陽離子，真菌通過鈣泵或Ca2+通道來控制細(xì)胞質(zhì)中的Ca2+濃度[5]。

鈣調(diào)磷酸酶CaN作為Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要元件，是一種絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白磷酸酶[6]，被激活后的CaN會使其下游的一些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生去磷酸化，從而在真菌生物學(xué)過程中起到調(diào)控作[7]。另外，CaN是目前所知唯一的一個活性受Ca2+和CaM調(diào)控的蛋白磷酸酶，由一個催化亞基CNA和調(diào)節(jié)亞基CNB以等量比例聚合而成的異源二聚體[7]。在鈣調(diào)磷酸酶級聯(lián)反應(yīng)中，CaM和CaN的調(diào)節(jié)亞基CNB充當(dāng)Ca2+信號的傳感器，細(xì)胞質(zhì)中游離的Ca2+會與CaM形成Ca2+/CaM復(fù)合物，該復(fù)合物與鈣調(diào)磷酸酶的催化亞基CNA和調(diào)節(jié)亞基CNB特異性結(jié)合，形成Ca2+/CaM-CaN復(fù)合物，產(chǎn)生功能性磷酸酶活性[8]。CsA是鈣調(diào)磷酸酶特異性抑制劑，其可通過與免疫親和蛋白CyP結(jié)合抑制CaN兩個亞基活性，從而抑制鈣信號級聯(lián)反應(yīng)[9]。已有大量研究表明CaN參與到多種真菌的生長發(fā)育、孢子形成以及細(xì)胞壁合成[8]。張世偉[10]研究發(fā)現(xiàn)在球孢白僵菌Beauveriabassiana中催化亞基CNA會影響該菌菌落形態(tài)、分生孢子產(chǎn)生以及對殺菌劑咯菌氰的敏感性。李志勇等[11]利用CaN抑制劑環(huán)孢素A處理發(fā)現(xiàn)CaN參與調(diào)控粟彎孢霉葉斑病菌Curvularialunata分生孢子的萌發(fā)。除此以外，在釀酒酵母[12]Saccharomycescerevisiae、大麥黑粉菌[13]Ustilagohordei、玉米黑粉菌[14]Ustilagomaydis、尖孢鐮刀菌[15]Fusariumoxysporum等真菌中發(fā)現(xiàn)CaN還參與真菌對逆境脅迫的響應(yīng)，可見CaN在真菌中的調(diào)控作用因病原物而異，存在多樣性和復(fù)雜性，且其在梨果黑斑病菌A.alternata中調(diào)控作用仍需進(jìn)一步研究。

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)采后生物學(xué)與技術(shù)團(tuán)隊(duì)已通過遺傳學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Ca2+信號途徑中關(guān)鍵成分磷脂酶C(phospholipase C)參與了梨果黑斑病菌營養(yǎng)生長、孢子萌發(fā)以及致病力調(diào)控過程[16]。同時有研究發(fā)現(xiàn)CaN是柑橘褐斑病菌A.alternata發(fā)育和致病所必須的[17]。為進(jìn)一步探究梨果黑斑病菌CaN基因的結(jié)構(gòu)和生物功能，本研究在對梨果黑斑病菌A.alternata中CaN的催化亞基CNA和調(diào)節(jié)亞基CNB基因克隆的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過RT-qPCR進(jìn)一步分析CaN在疏水及果蠟誘導(dǎo)A.alternata孢子萌發(fā)、附著胞形成等過程中的表達(dá)情況。同時用CaN抑制劑CsA處理A.alternata，分析在疏水、蠟質(zhì)等的誘導(dǎo)下CaN對A.alternata侵染結(jié)構(gòu)形成的調(diào)控，并通過體內(nèi)試驗(yàn)研究其對該病菌致病性的影響，以期進(jìn)一步揭示Ca2+信號途徑中關(guān)鍵成分CaN在疏水及蠟質(zhì)誘導(dǎo)A.alternata侵染結(jié)構(gòu)分化及致病性中具體的調(diào)控機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株 梨黑斑病病菌A.alternata菌株(KY397985.1)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)采后生物學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存的菌種，經(jīng)活化3代后使用。

1.1.2 供試果實(shí) 早酥梨Pyrusbretchneidericv.Zaosu采自甘肅省條山農(nóng)場，挑選符合試驗(yàn)要求的早酥梨，于當(dāng)天運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，置于冷庫貯藏，待用。

1.2 方 法

1.2.1 梨果黑斑病菌A.alternata基因組DNA及RNA的提取 用液氮將新鮮菌絲研磨成粉末狀，使用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，用TRNzol試劑提取RNA。將部分提取的RNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRaCode.RR047B)試劑盒進(jìn)行cDNA合成。

1.2.2 梨果黑斑病菌AaCNA和AaCNB基因克隆 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載A.alternata的鈣調(diào)磷酸酶CNA和CNB的基因序列，利用DNAMAN 6.0設(shè)計(jì)AaCNA和AaCNB的擴(kuò)增引物(表1)，以A.alternata的cDNA為模板進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。

表1 擴(kuò)增目的基因引物序列

1.2.3AaCNA和AaCNB基因序列和編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 利用在線網(wǎng)址進(jìn)行目的基因及其編碼產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析，預(yù)測網(wǎng)址如表2所示。

表2 在線預(yù)測網(wǎng)址

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR分析 稱取0.1 g果蠟溶至10 mL氯仿，將疏水Gelbond膜(接觸角為74.63°±1.24°)剪切至蓋玻片大小(5 cm× 2 cm)，一部分疏水膜不作處理，在另一部分疏水膜上涂上40 μL果蠟(接觸角為101°)，室溫放置4 h，使氯仿充分揮發(fā)。將上述兩種疏水膜放置在載玻片上，然后在其上滴加20 μL濃度為5×105mL-1孢子懸浮液，在黑暗條件下培養(yǎng)，分別在 2 h、4 h、6 h、8 h取樣。用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法檢測A.alternata中AaCNA和AaCNB基因在不同侵染結(jié)構(gòu)形成的4個時間(2、4、6、8 h)中mRNA轉(zhuǎn)錄水平。以磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)為內(nèi)參基因。擴(kuò)增各片段所需引物見表3。

稱取0.1 g果蠟溶至10 mL氯仿，將疏水Gelbond膜(接觸角為74.63°±1.24°)剪切至蓋玻片大小(5 cm×2 cm)，一部分疏水膜不作處理，在另一部分疏水膜上涂上40 μL果蠟(接觸角為101°)，室溫放置4 h，使氯仿充分揮發(fā)。將上述兩種疏水膜放置在載玻片上，然后在其上滴加20 μL濃度為5×105mL-1孢子懸浮液，在黑暗條件下培養(yǎng)，分別在2 h、4 h、6 h、8 h取樣。用SYBR GreenⅠReal Time PCR方法檢測A.alternata中AaCNA和AaCNB基因在不同侵染結(jié)構(gòu)形成的4個時間(2、4、6、8 h)中mRNA轉(zhuǎn)錄水平。以磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH(Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)為內(nèi)參基因。擴(kuò)增各片段所需引物見表3。

表3 基因定量引物序列

1.2.5 CaN在疏水、蠟質(zhì)條件下對A.alternata侵染結(jié)構(gòu)形成的影響 將A.alternata孢子懸浮液離心棄去上清液，然后向沉淀物中加入2 mL 濃度為0.1 μmol/L CsA溶液，以加入2 mL無菌水作為對照，震蕩懸浮菌體。將處理好的孢子懸浮液(20 μL)分別滴在有、無蠟質(zhì)處理的疏水性Gelbond膜面上，分別在2 h、4 h、6 h和8 h計(jì)數(shù)孢子萌發(fā)率和附著胞的形成率。

1.2.6 CaN對A.alternata致病力的影響 選擇大小均勻、無病無損傷的早酥梨果實(shí)，用2%的NaClO溶液進(jìn)行消毒2 min，之后用蒸餾水沖洗，晾干，再用75%的酒精對果實(shí)表皮進(jìn)行擦拭消毒，然后用直徑3 mm的打孔鐵釘均勻的在果實(shí)赤道部位打3個孔，每孔中接種上濃度為1×106mL-1的A.alternata孢子懸浮液20 μL，在接種2 h后，處理組向每個孔中接入20 μL的濃度為10 μmol/L CsA溶液，無菌水作為對照。在室溫下晾干，用規(guī)格為30 cm×45 cm，厚0.02 mm的市售保鮮袋包裝，室溫條件下，以十字交叉法每 2 d 1次，測果實(shí)的病斑直徑，每個處理用果實(shí)9個，每個處理分別重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差并作圖，用SPSS 20.0進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AaCNA和AaCNB基因克隆

以梨果黑斑病菌A.alternata的cDNA為模板，利用特異性引物AaCNA-F/R和AaCNB-F/R對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)，得到大小分別為 1 660 bp左右的AaCNA和528 bp左右的AaCNB(圖1)。

M.2 000 Marker；1～4.AaCNA PCR結(jié)果；5～6.AaCNB PCR結(jié)果

2.2 AaCNA和AaCNB蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1AaCNA和AaCNB基因結(jié)構(gòu) 基因結(jié)構(gòu)及序列信息分析表明，AaCNA基因全長為 1 900 bp，包含4個內(nèi)含子和5個外顯子，內(nèi)含子長度分別為100、46、45、49 bp，其CDS區(qū)長度為 1 660 bp，共編碼551個氨基酸；AaCNB基因全長為715 bp，包含3個內(nèi)含子和4個外顯子，內(nèi)含子長度分別為76、54、57 bp，其CDS區(qū)長度為528 bp，共編碼174個氨基酸(圖2)。

圖2 AaCNA和AaCNB基因結(jié)構(gòu)

2.2.2AaCNA和AaCNB基因編碼產(chǎn)物理化性質(zhì) 對AaCNA和AaCNB編碼蛋白理化性質(zhì)預(yù)測表明，AaCNA分子質(zhì)量為63 310.97 u，化學(xué)式為C2823H4361N763O839S28，理論等電點(diǎn)為 5.61，負(fù)電荷殘基數(shù)(78)均大于正電荷殘基數(shù)(63)，屬于酸性蛋白，AaCNA總平均親水性(-0.467)小于0，脂肪系數(shù)(76.66)低于100，不穩(wěn)定系數(shù)(46.87)大于40，表明AaCNA屬于親水性不穩(wěn)定蛋白；AaCNB分子質(zhì)量為19 751.17 u，化學(xué)式為C859H1 359N233O282S9，其等電點(diǎn)為4.47，負(fù)電荷殘基數(shù)(33)大于正電荷殘基數(shù)(21)，屬于酸性蛋白，AaCNB總平均親水性(-0.478)小于0，脂肪系數(shù)(77.30)低于100，不穩(wěn)定系數(shù)(33.39)小于40，表明AaCNB屬于親水性穩(wěn)定蛋白。

2.2.3 AaCNA和AaCNB結(jié)構(gòu)域分析 通過SMART網(wǎng)站在線分析AaCNA和AaCNB氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域，并通過IBS 1.0軟件繪制AaCNA和AaCNB蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，鈣調(diào)磷酸酶催化亞基CNA從N端到C端依次是催化結(jié)構(gòu)域(Catalytic domian，CD)，B亞基結(jié)合螺旋(B subunit binding helix，BBH)，CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CaM binding domain，CBD)，自抑制結(jié)構(gòu)域(Autoinhibitiory，AID)，其中后面3個區(qū)域共同調(diào)節(jié)催化亞基的功能。CNB是一個由174個氨基酸組成的多肽,屬于EF-hand Ca2+結(jié)合蛋白家族，4個Ca2+離子結(jié)合位點(diǎn)填充4個Ca2+(圖3)。

圖3 AaCNA和AaCNB的結(jié)構(gòu)域分析

2.2.4AaCNA和AaCNB系統(tǒng)進(jìn)化樹 利用NCBI下載了部分真菌的CNA與CNB的同源物，通過鄰近法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，Bootstrap值為1 000，其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。結(jié)果表明，AaCNA和AaCNB分別與Mytilinidionresinicola和Alternariaburnsii基因聚于同一分支，親緣關(guān)系最近，同源性分別高達(dá)80.61%和99.05%(圖4)。

圖4 AaCNA和AaCNB的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2.5 AaCNA和AaCNB跨膜結(jié)構(gòu)域和親/疏水性分析 利用TMHMM Serverv.2.0預(yù)測AaCNA和AaCNB蛋白的跨膜區(qū)域，結(jié)果顯示，AaCNA和AaCNB蛋白均無跨膜區(qū)，屬于非跨膜蛋白(圖5-A、圖5-B)。利用ProtScale預(yù)測AaCNA和AaCNB蛋白的親疏水性，圖中正值區(qū)域表示疏水區(qū)域，而負(fù)值區(qū)域是親水區(qū)域，發(fā)現(xiàn)AaCNA和AaCNB整體親水性氨基酸平均分值大于疏水性氨基酸，初步推測AaCNA和AaCNB蛋白均為親水性蛋白(圖5-C、圖5-D)。

圖5 AaCNA和AaCNB蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域(A、B)和親疏水性(C、D)預(yù)測

2.2.6 AaCNA和AaCNB二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過對蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析可知AaCNA二級結(jié)構(gòu)含有47.37% α-螺旋(藍(lán)色)、13.07% 延伸鏈(紅色)、5.63% β-轉(zhuǎn)角(綠色)和33.94%無規(guī)卷曲(紫色)。AaCNB二級結(jié)構(gòu)含有 52.30% α-螺旋、7.47%延伸鏈、7.47% β-轉(zhuǎn)角和32.76% 無規(guī)卷曲(圖6-A)。利用在線工具SWISS-MODEL對AaCNA和AaCNB蛋白進(jìn)行同源建模得到三級結(jié)構(gòu)圖(圖6-B)。

圖6 AaCNA和AaCNB的二(A)、三級(B)結(jié)構(gòu)

2.2.7 AaCNA和AaCNB亞細(xì)胞定位與AaCNA和AaCNB磷酸化位點(diǎn)分析 利用PSORT預(yù)測結(jié)果表明，AaCNA和AaCNB均主要定位于細(xì)胞核上(表4)。利用NetPhos 3.1 Server在線分析工具預(yù)測AaCNA和AaCNB中的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AaCNA蛋白存在29個絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，19個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和19個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。AaCNB蛋白存在10個絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，3個蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和1個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖7)。

表4 AaCNA和AaCNB亞細(xì)胞定位預(yù)測

圖7 AaCNA和AaCNB蛋白的磷酸位點(diǎn)分析

2.3 AaCNA和AaCNB在疏水及果蠟涂膜表面誘導(dǎo)侵染分化中的表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果顯示，AaCNA和AaCNB基因在疏水、蠟質(zhì)涂膜表面均顯著上調(diào)，但誘導(dǎo)水平各不相同(圖8)。以A.alternata萌發(fā)初級階段(2 h)作為對照，AaCNA表達(dá)量在侵染結(jié)構(gòu)形成階段均有所上調(diào)，在侵染菌絲形成階段(8 h)的表達(dá)量最高，其表達(dá)量在疏水和蠟質(zhì)表面分別上調(diào)了5.45倍和7.49倍。AaCNB表達(dá)量在侵染結(jié)構(gòu)形成階段呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢，在附著胞形成階段(6 h)的表達(dá)量達(dá)到峰值，其表達(dá)量在疏水和蠟質(zhì)表面分別上調(diào)了7.87倍和8.53倍。

豎線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(± SE)。不同字母代表顯著性差異(P<0.05)，下同

2.4 CaN對侵染結(jié)構(gòu)分化的調(diào)控

2.4.1 CaN在疏水、蠟質(zhì)條件下對A.alternata侵染結(jié)構(gòu)形成的調(diào)控 CaN抑制劑CsA處理顯著降低A.alternata孢子萌發(fā)率和附著胞形成率，但相較于疏水表面，在蠟質(zhì)表面A.alternata孢子萌發(fā)率和附著胞形成率較高。與對照組相比，使用CsA處理8 h時，在疏水表面A.alternata孢子萌發(fā)率降低47.1%，附著胞形成率降低68.1%，而在蠟質(zhì)表面A.alternata孢子萌發(fā)率降低41.4%，附著胞形成率降低39.0%(圖9)。

圖9 CsA處理在疏水、蠟質(zhì)誘導(dǎo)A.alternata孢子萌發(fā)率和附著胞形成率

2.4.2 CaN對A.alternata致病力的調(diào)控 使用CaN抑制劑CsA處理可抑制損傷接種A.alternata梨果黑斑病的擴(kuò)展(圖10)。在第7 天時，CsA處理相對于對照組病斑直徑減少 52.3%。

圖10 CsA處理對早酥梨黑斑病擴(kuò)展的影響

3 討 論

本試驗(yàn)從A.alternata中克隆得到CaN的催化亞基AaCNA和調(diào)節(jié)亞基AaCNB。通過生物信息學(xué)分析得出，這兩個基因雖都為親水性蛋白，但兩個蛋白的親水程度不一樣，而這與蛋白穩(wěn)定性有一定的關(guān)系，分析得出AaCNA為不穩(wěn)定蛋白，而AaCNB為穩(wěn)定蛋白。通常認(rèn)為蛋白質(zhì)分子是否穩(wěn)定是由α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)決定，伸展結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲則決定蛋白質(zhì)的功能[18]。通過對兩基因蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析可知，AaCNA和AaCNB編碼的蛋白主要由α-螺旋和不規(guī)則卷曲構(gòu)成，而β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈則散布于整個蛋白質(zhì)中。這一結(jié)果與劉艷梅等[19]報道的玉米大斑病菌CNB二級結(jié)構(gòu)預(yù)測一致。磷酸化參與多種細(xì)胞生命活動，如信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)等[20]。潛在磷酸化位點(diǎn)越多，可能發(fā)揮更多的功能。通過對AaCNA和AaCNB進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)分析得出AaCNA磷酸化位點(diǎn)較AaCNB要多，說明AaCNA應(yīng)用功能作用更大一些，這一結(jié)果與Heng等[21]得出的CaN酶活功能主要由催化亞基CAN決定的結(jié)論相對應(yīng)。蛋白質(zhì)需要處于細(xì)胞中特定的亞細(xì)胞才能發(fā)揮其功能，亞細(xì)胞定位也在一定程度上反映了其對應(yīng)基因的功能。預(yù)測AaCNA和AaCNB在細(xì)胞中的可能分布位置，結(jié)果顯示AaCNA和AaCNB均定位在細(xì)胞核上，而劉艷梅等[19]報道玉米大斑病菌CNB亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)，表明其定位因病原物而異。本研究進(jìn)一步通過蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，AaCNA包括一個N端催化結(jié)構(gòu)域，CNB結(jié)合結(jié)構(gòu)域，鈣調(diào)素CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域和自抑制蛋白結(jié)構(gòu)域，其中后面3個區(qū)域共同調(diào)節(jié)催化亞基的功能。這一結(jié)論與李志勇等[11]在粟彎孢霉葉斑病菌ClCna得出的關(guān)于結(jié)構(gòu)域的分析一致，說明CNA基因在植物病原真菌進(jìn)化過程存在保守性。有研究指出鈣調(diào)磷酸酶催化亞基CNA必須與CNB和CaM結(jié)合后才能行使催化功能，對其下游基因進(jìn)行調(diào)控[22]。AaCNB在結(jié)構(gòu)上與CaM相似，有4個Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。這一結(jié)論與Juvvadi等[23]得出的關(guān)于CNB結(jié)構(gòu)域的分析一致，表明其Ca2+結(jié)合區(qū)域具有高度保守性。

前期研究表明，A.alternata是重要的采后病原菌之一，具有明顯的潛伏侵染特性[24]，當(dāng)孢子接觸到果實(shí)表面時，果實(shí)表面的一些物化信號會刺激孢子萌發(fā)、隨后形成芽管、芽管頂端膨大形成附著胞，而后分化形成侵染菌絲，從而引起果蔬發(fā)生病害。已證明寄主表面疏水性和蠟質(zhì)等物理化學(xué)特性對真菌病原物的侵染具有一定的調(diào)控作用[25-26]。早期有研究報道疏水性這一信號可以誘導(dǎo)真菌產(chǎn)生附著胞[27]，除此以外，植物表皮蠟質(zhì)和角質(zhì)能誘導(dǎo)真菌病原物附著胞的分化[28]。RT-qPCR分析表明，在侵染結(jié)構(gòu)形成過程中，以A.alternata萌發(fā)初級階段(2 h)作為對照，AaCNA和AaCNB基因無論在疏水還是果蠟提取物涂層表面上均顯著上調(diào)，但在疏水表面AaCNA和AaCNB基因的表達(dá)量均低于蠟質(zhì)涂膜表面，進(jìn)一步說明梨果皮蠟質(zhì)在CaN對A.alternata侵染結(jié)構(gòu)的形成中發(fā)揮了積極作用。根據(jù)AaCNA和AaCNB轉(zhuǎn)錄水平峰值出現(xiàn)的時間，推測在A.alternata中AaCNA可能主要作用于侵染菌絲的形成，而AaCNB則有助于附著胞的形成?？梢娫贑a2+信號途徑中AaCNA和AaCNB均參與了梨果黑斑病菌A.alternata侵染結(jié)構(gòu)形成的調(diào)控。

藥理學(xué)結(jié)果表明，CsA處理可降低A.alternata孢子萌發(fā)和附著胞形成，但與疏水表面相比，蠟質(zhì)表面孢子萌發(fā)率和附著胞形成率較高，說明蠟質(zhì)可誘導(dǎo)真菌形成侵染結(jié)構(gòu)，這與Reisige等[29]研究發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)可誘導(dǎo)Pucciniagraminisf.sp.tritici.形成附著胞，也誘導(dǎo)50%芽管產(chǎn)生侵入釘?shù)那秩窘Y(jié)構(gòu)這一結(jié)果一致。同樣，用免疫抑制劑CsA處理灰葡萄孢后，侵染結(jié)構(gòu)的形成受到抑制[30]。在新型隱球酵母Cryptococcusneoformans中，CaN參與了對孢子產(chǎn)生過程的調(diào)控[31]。此外，研究發(fā)現(xiàn)柑橘A.alternata中CaN催化亞基突變體分生孢子的產(chǎn)生完全受到了抑制[17]?？梢?，CaN作為Ca2+信號通路下游的靶蛋白對病原真菌的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。本研究從A.alternata中克隆得到AaCNA和AaCNB基因，利用生物信息學(xué)分析進(jìn)一步了解AaCAN，qRT-PCR分析和藥理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果均表明AaCAN參與了A.alternata在疏水、蠟質(zhì)誘導(dǎo)下侵染結(jié)構(gòu)形成的調(diào)控，但其調(diào)控的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步揭示。