周建強，司 思，祁增源，韓銀倉，劉 秀，孫永剛

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室，蘭州 730070；2.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

牦牛主要分布在青藏高原及其毗鄰的高山和亞高山地區(qū)，是典型的放牧家畜[1]。牦牛是中國稀有而珍貴的遺傳資源，中國牦?？偭考s1 500萬頭，占世界牦?？偭康?5%以上[2]。牦牛生長緩慢、飼養(yǎng)條件粗放、生產(chǎn)性能低下，使得其經(jīng)濟效益和生產(chǎn)效率較低[3]。

SMAD蛋白家族是將轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)超家族成員包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)、活化素等多個成員的信號傳導(dǎo)至細胞核的介導(dǎo)蛋白[4]。TGF-β在調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化、遷移和凋亡中起重要作用，可參與器官和組織的生長發(fā)育過程[5-6]。目前，SMAD蛋白已發(fā)現(xiàn)至少有8種(SMAD1～8)，其中，SMAD1～3、SMAD5、SMAD8是受體激活型SMAD蛋白(Recepter Activated SMAD,R-SMADs)[7]；SMAD4是通用調(diào)節(jié)型SMAD蛋白(Common mediator SMADs,C-SMAD)[8]；SMAD6和SMAD7是抑制型SMAD蛋白(Inhibitory SMADs, I-SMADs)[9]。

研究表明，BMPs的生物學(xué)作用幾乎涉及機體所有系統(tǒng)，其不只限于調(diào)控骨骼的形成和發(fā)育，并且在動物的生長發(fā)育過程中起著重要作用[10]。SMAD1、SMAD5、SMAD8能被BMP受體磷酸化，參與BMP信號的傳導(dǎo)，進而調(diào)控動物的生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，在鼠的骨骼肌細胞核中定位并敲除SMAD1、SMAD5、SMAD8基因后，其肌肉量減少。對鼠胚胎干細胞(ESCs)進行分析，發(fā)現(xiàn)SMAD1、SMAD4和SMAD5占據(jù)一組生長調(diào)節(jié)因子，而這組調(diào)節(jié)因子的功能是促進ESCs快速分化[11]。研究發(fā)現(xiàn)，BMP-SMAD1、SMAD5、SMAD8通路能與SMAD2、SMAD3通路競爭SMAD4，從而提高肌肉量及促進成肌分化過程[12]。同時，關(guān)于SMAD1基因的研究多集中在小鼠、大鼠、人類及其在一些疾病方面的作用，而SMAD1基因與牦牛生長發(fā)育及生長性狀的關(guān)聯(lián)性則鮮有報道。因此，本研究將牦牛SMAD1基因作為候選基因，采用DNA測序和單倍型分型技術(shù)，對青海牦牛SMAD1基因第1外顯子進行SNPs檢測，尋找與牦牛生長性狀相關(guān)的SNPs位點，以期為牦牛分子育種以及SMAD1基因的功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在青海省海北州祁連縣野牛溝鄉(xiāng)邊麻梅龍掌合作社隨機選擇成年(3歲)健康高原型母牦牛440頭，頸靜脈采血10 mL，ACD抗凝(VACD∶V血液=1∶6)，輕微搖動混勻樣品后置于-80 ℃保存，備用。同時測量記錄牦牛的體質(zhì)量、體斜長、體高、胸圍和管圍5個體尺指標。

1.2 基因組DNA提取及檢測

根據(jù)血液DNA提取試劑盒(天根，北京)的方法從血液中提取基因組DNA。用超微量分光光度計(NanoDrop one)檢測DNA的濃度，用 8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，-20 ℃保存，備用。

1.3 引物設(shè)計和PCR擴增

在NCBI中查詢牦牛SMAD1(NW_005395284.1)的基因序列，設(shè)計PCR引物(用Primer 5.0軟件)。引物信息見表1(由上海生工生物工程有限公司合成)。

表1 引物序列信息

PCR反應(yīng)體系25.0 μL：上游、下游引物各0.7 μL(10 pmol/μL)、Mix 12.5 μL(內(nèi)含TaqDNA聚合酶、10×Buffer、dNTPs等)、DNA模板1.0 μL(50 ng/μL)，加ddH2O 10.1 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.4 SNPs檢測

PCR擴增產(chǎn)物用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴增質(zhì)量較好的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行純化測序。使用Seqman軟件對測序結(jié)果進行對比分析，尋找SNPs位點。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 2010進行基因型統(tǒng)計，分析計算遺傳多態(tài)性，包括基因型、等位基因頻率、遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)，并對SMAD1基因多態(tài)性位點在牦牛群體中的基因型分布進行卡方檢驗[13]。采用SPSS 23.0軟件中一般線性模型分析SNPs位點與生長性狀的關(guān)聯(lián)性。對SMAD1基因5個SNPs位點進行連鎖不平衡、單倍型分析(使用Haploview 3.32軟件)。分析基因型效應(yīng)對生長性狀的影響。采用固定模型:

Yij=μ+Gi+Eij

式中，Yij為個體表型值；μ為群體均值；Gi為標記基因型效應(yīng)；Eij為隨機誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 SMAD1基因SNPs的遺傳特征分析

測序分析發(fā)現(xiàn)，牦牛SMAD1基因第1外顯子存在5個SNPs位點(圖1)，分別是g.35084C>T、g.35111C>T、g.35171G>A、g.35312C>T和g.35333G>A；g.35084C>T和g.35111C>T均存在CC和CT 2 種基因型；g.35171G>A存在GG、GA和AA 3 種基因型；g.35312C>T存在CC、CT和TT 3 種基因型；g.35333G>A存在GG和GA 2 種基因型。

A.g.35084C>T; B.g.35111C>T; C.g.35333G>A ; D.g.35171G>A; E.g.35312C>T

牦牛SMAD1基因第1外顯子遺傳多態(tài)性分析結(jié)果見表2，在SMAD1上的g.35084C>T和g.35111C>T的優(yōu)勢基因型均是CC，優(yōu)勢等位基因均是C；g.35171G>A和g.35333G>A的優(yōu)勢基因型均是GG，優(yōu)勢等位基因均是G；g.35312C>T突變位點的優(yōu)勢基因型是CC，優(yōu)勢等位基因是C?？ǚ綑z驗表明g.35084C>T、g.35111C>T和g.35312C>T 3個突變位點均處于Hardy Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，g.35171G>A和g.35333G>A處于極不平衡狀態(tài)(P< 0.01)；g.35084C>T、g.35111C>T和g.35333G>A處于低度多態(tài)水平(PIC<0.25)，g.35171G>A和g.35312C>T處于中度多態(tài)水平(0.25A雜合度最大，g.35111C>T最小；有效等位基因數(shù)均大于1，且g.35171G>A最大，g.35111C>T最小。

表2 牦牛 SMAD1基因遺傳多態(tài)性分析

2.2 牦牛 SMAD1基因突變位點基因型對生長性狀的影響

由表3可知，g.35084C>T位點與胸圍顯著相關(guān)，CT基因型個體的胸圍極顯著大于CC基因型個體(P<0.01)，其他指標差異不顯著(P> 0.05)；g.35111C>T位點與體斜長、胸圍顯著相關(guān)，CT基因型個體的體斜長和胸圍極顯著大于CC基因型個體(P<0.01)，其他指標差異不顯著(P> 0.05)；g.35171G>A和g.35312C>T位點與體質(zhì)量、體高、體斜長和胸圍顯著相關(guān)，其中，g.35171G>A位點AA基因型和GA基因型個體的體質(zhì)量、體高、體斜長和胸圍均極顯著大于GG基因型個體(P<0.01)，g.35312C>T位點CT基因型個體的體質(zhì)量、體高、體斜長和胸圍均極顯著大于CC基因型個體(P<0.01)，其他指標差異不顯著(P>0.05)；g.35333G>A位點與胸圍、體高顯著相關(guān)，GA基因型個體的體高顯著大于GG基因型個體(P<0.05)，胸圍極顯著大于GG基因型個體(P<0.01)，其他指標差異不顯著(P>0.05)。

表3 SAMD1第1外顯子5個突變位點與牦牛生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析

2.3 SMAD1基因SNPs位點的單倍型和連鎖不平衡分析

對SMAD1基因上5個SNPs位點進行單倍型分析，將發(fā)生頻率低于5.00%的單倍型剔除，檢測到6種單倍型，分別為Hap1～Hap6(表4)。其中單倍型Hap3的發(fā)生頻率最高為0.425，是主要單倍型，單倍型Hap6的發(fā)生頻率最低為 0.055。

表4 牦牛 SMAD1基因突變位點單倍型分析

通過表5得出，SMAD1基因各個位點間不存在強的連鎖不平衡效應(yīng)，5個SNPs位點兩兩間的D′< 0.8，r2<0.33(D′>0.8，r2>0.33時為強連鎖不平衡)。

表5 牦牛 SMAD1基因突變位點連鎖不平衡分析

2.4 SMAD1基因SNP位點組合單倍型對牦牛生長性狀的影響

軟件分析發(fā)現(xiàn)，SMAD1基因中5個SNPs位點共有9種組合單倍型，將發(fā)生頻率低于 5.00%的5種組合單倍型定義為其他類型，并剔除，將其余的組合單倍型與牦牛的生長性狀進行關(guān)聯(lián)性分析。由表6得出，組合單倍型H3H6的個體均值在體質(zhì)量、體高、體斜長、胸圍和管圍指標均極顯著高于H3H2、H3H4和H3H3組合單倍型的個體均值(P<0.01)。綜上可得，組合單倍型H3H6可能是影響牦牛生長性狀的最優(yōu)組合單倍型。

表6 SMAD1基因突變位點組合單倍型與牦牛生長性狀關(guān)聯(lián)性分析

3 討 論

生長性狀是衡量家畜個體生長發(fā)育和經(jīng)濟效益的一個重要指標，在育種學(xué)中具有重要的價值。將基因多態(tài)性與生長性狀聯(lián)系起來，選育出生長發(fā)育快的個體，可以有效縮短對生長性狀的選育年限[14]。SMAD1不僅在促進骨骼形成方面有重要作用[15]，且對激素分泌和生長也有重要作用[16]。研究表明，SMAD1參與BMP信號通路來調(diào)控成年肌肉量變化，并對成肌因子和分化過程有重要作用[12,17]。鐘昕[18]和王鑫磊[19]發(fā)現(xiàn)BMP基因的多態(tài)性與黃牛的生長性狀有較大的關(guān)聯(lián)性。所以，推測SMAD1基因與生長性狀有一定的關(guān)聯(lián)。

SMAD1基因在家畜中的研究較少。寧越等[20]證實SMAD1基因可正向調(diào)控秦川牛原代成肌細胞分化。池秋蝶等[21]研究發(fā)現(xiàn)文蛤SMAD1基因多態(tài)性與文蛤的生長性狀顯著相關(guān)。本試驗采用DNA直接測序法進行基因型分型，在牦牛SMAD1基因第1外顯子上發(fā)現(xiàn)5個突變位點，根據(jù)卡方檢驗可看出g.35084C>T、g.35111C>T和g.35312C>T 3個突變位點均處于Hardy Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，可知，在有突變的情況下，經(jīng)自然選擇、人為選育的干擾，最終各種因素相互抵消，使得群體處于遺傳動態(tài)平衡狀態(tài)[22]；g.35171G>A和g.35333G>A處于極不平衡狀態(tài)(P<0.01)，可能是環(huán)境或者人為因素影響。對于群體而言，多態(tài)信息含量高、雜合度大、有效等位基因數(shù)目多，則該位點的遺傳變異性就高，說明其有較大的選擇潛力[23]。g.35084C>T、g.35111C>T和g.35333G>A雜合度小，有效等位基因數(shù)目少且處于低度多態(tài)(PIC<0.25)，說明這3個位點多態(tài)性較少且選擇潛力較?。籫.35171G>A和g.35312C>T雜合度大，有效等位基因數(shù)目多且處于中度多態(tài)(0.25

關(guān)聯(lián)性分析得出，牦牛SMAD1基因的5個位點均與部分體尺指標顯著相關(guān)，且均與胸圍指標有顯著相關(guān)，可能與SMAD1在促進骨骼形成方面有重要作用有關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)不僅單個SNPs會影響動物的表型，而且組合效應(yīng)也會影響動物的表型[24]。李愛民等[25]研究發(fā)現(xiàn)ANGPTL6基因3個SNPs之間的組合均與魯西牛生長性狀顯著相關(guān)。徐懷超等[26]研究發(fā)現(xiàn)CRTC3基因不同組合單倍型與秦川牛生長性狀有顯著關(guān)聯(lián)。本試驗將SMAD1基因中的4種組合單倍型與牦牛生長性狀進行關(guān)聯(lián)性分析得出，4種組合單倍型均與牦牛生長性狀有著極顯著和顯著的關(guān)系，且組合單倍型H3H6可能是影響牦牛生長性狀的最優(yōu)組合單倍型。

4 結(jié) 論

SMAD1基因在牦牛中存在多態(tài)性，且發(fā)現(xiàn)的5個位點均與生長性狀顯著關(guān)聯(lián)，優(yōu)勢單倍型組合是H3H6。所以，可以將SMAD1作為分子標記輔助選擇的候選基因，應(yīng)用在牦牛分子標記輔助育種中，縮短育種周期，加快牦牛產(chǎn)業(yè)的 發(fā)展。