許 浩，胡碧川，鄒 偉，段雅斌

(襄陽市中醫(yī)院普外科，湖北 襄陽 441099)

胃癌(gastric cancer，GC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，臨床癥狀有消瘦乏力、上腹部痛、嘔血、黑便等，常伴胃出血、胃穿孔、幽門梗阻、賁門梗阻，飲食不規(guī)律、幽門螺旋桿菌感染、慢性胃部疾病、家族遺傳等是主要致病因素[1]。我國胃癌發(fā)病率約30/10 萬，中老年男性為發(fā)病高風(fēng)險(xiǎn)人群，致死率超過20/10萬[2]。

目前，根治性外科手術(shù)是治療胃癌的主要手段，但超過43%的患者接受根治術(shù)治療后仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，沒有達(dá)到理想療效，總體預(yù)后不佳[3]。根治術(shù)作為一種創(chuàng)傷性操作，極易引起機(jī)體過度應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)，大量分泌C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)等急性期反應(yīng)蛋白，導(dǎo)致器官損傷加重，嚴(yán)重影響預(yù)后效果[4-5]。研究顯示，細(xì)胞程序性死亡-配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)在晚期胃癌中呈高表達(dá)狀態(tài)，促使T 細(xì)胞失活、凋亡，從而協(xié)助癌細(xì)胞潛伏和轉(zhuǎn)移，影響治療效果，高表達(dá)患者5 年生存率低于40%[6]。近年來，腫瘤組織中PD-L1 的表達(dá)情況成為了研究熱點(diǎn)，但其在外周血中的濃度如何鮮有報(bào)道[7]。而腫瘤血管是為癌細(xì)胞提供氧和營養(yǎng)物質(zhì)的輸送通道，幫助胃癌實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，其中促血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)是一種啟動(dòng)、調(diào)控腫瘤血管新生的糖蛋白。研究顯示，Ang-2 在多種腫瘤組織均有表達(dá)，可用于鑒別腫瘤的良、惡性，是腫瘤生長、癌細(xì)胞擴(kuò)散的重要標(biāo)志，但對(duì)于胃癌組織中Ang-2的表達(dá)報(bào)道較少[8]。因此，本研究旨在探討Ⅲ期胃癌患者行根治術(shù)前血清CRP、PD-L1、Ang-2 濃度與腫瘤直徑、脈管和神經(jīng)侵犯度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等病理指標(biāo)的關(guān)系，分析預(yù)后的影響因素，為今后有效的防控和治療胃癌提供理論參考，對(duì)改善患者預(yù)后具有重要價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取 2017 年 1 月—2021 年 4 月于襄陽市中醫(yī)院普外科行手術(shù)治療的Ⅲ期胃癌患者116 例，男性61 例，女性55例，患者均有完整的病歷記錄，術(shù)前均未接受放療或化療，同期選取襄陽市中醫(yī)院健康體檢者100例作為對(duì)照組，病例均經(jīng)本人及家屬同意并簽署書面知情書，本研究經(jīng)襄陽市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2017-SL-0016)后實(shí)施。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 胃癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)、美國癌癥聯(lián)合會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)聯(lián)合頒布的第8 版消化系統(tǒng)腫瘤TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)[9]，根據(jù)胃癌原發(fā)灶的侵犯范圍、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況、是否存在遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移進(jìn)行組合，分類級(jí)別等來判斷胃癌病程。

1.2.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)：①依據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)發(fā)布2019 版《WHO 消化系統(tǒng)腫瘤分類》確定患者符合Ⅲ期胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；②患者入院后均接受腹部CT和胃鏡檢查，經(jīng)病理切片活檢確診[11]；③患者均首次接受胃癌根治術(shù)治療；④患者年齡>18 歲，性別不限；⑤患者治療前后均有詳細(xì)病歷記錄。

研究對(duì)象的排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者合并慢性胃炎；②患者合并嚴(yán)重肝、腎功能障礙；③患者合并血液類疾??；④患者屬過敏體質(zhì)；⑤女性患者處于妊娠、哺乳期；⑥患者身體情況無法應(yīng)用化療藥物進(jìn)行輔助治療。

1.3 資料收集

收集患者的一般資料包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、既往病史等，術(shù)前2 d 抽取約15 mL空腹肘靜脈血送至檢驗(yàn)科檢測(cè)。記錄胃癌根治術(shù)治療數(shù)據(jù)包括手術(shù)類型、手術(shù)時(shí)長、術(shù)后輔助化療方案等，將患者離體標(biāo)本送至病理科檢查，病理報(bào)告包括腫瘤位置、腫瘤直徑、脈管及神經(jīng)侵犯情況、浸潤深度、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、臨床分期等。

1.4 ELISA法測(cè)定術(shù)前血清中CRP、PD-L1、Ang-2濃度

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)[12]對(duì)胃癌患者術(shù)前血清指標(biāo)進(jìn)行定量檢測(cè)。取患者術(shù)前2 d 空腹肘靜脈血1.5 mL分別置于3支采血管中，3 000 r/min離心10 min后取上清液以1∶2稀釋樣品，將樣品和抗體的稀釋液各100 μL 于37 ℃恒溫下濕育2.5 h，充分反應(yīng)后加入TMB 溶液 100 μL 顯色 45 min 即可加入終止液進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測(cè)樣品吸光度D(450)值，于標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品濃度，記錄血清CRP、PD-L1、Ang-2蛋白濃度，試劑盒均購自武漢菲恩生物科技有限公司，具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.5 治療方法

患者均接受第二站淋巴結(jié)清掃并完整切除了腫瘤原發(fā)灶，切除病灶及清掃胃周、腹腔干、十二指腸韌帶周圍的淋巴結(jié)?；颊咝g(shù)后均接受輔助化療，方案為卡培他濱、奧沙利鉑聯(lián)合治療約6 個(gè)月，共8 個(gè)周期療程，每療程21天。每周期第1天靜脈滴注奧沙利鉑130 mg/m2；第1 天至第14 天每日兩次口服卡培他濱1 000 mg/m2；休息1周再行第2療程。

1.6 隨 訪

通過電話、門診、網(wǎng)絡(luò)醫(yī)學(xué)平臺(tái)問診等方式對(duì)術(shù)后出院患者進(jìn)行1 年隨訪，隨訪間期為2~5 個(gè)月，隨訪內(nèi)容包括病史調(diào)查、體格檢查、生化檢查、胃鏡內(nèi)檢、營養(yǎng)監(jiān)測(cè)等。生存期(overall survival，OS)定義為患者行根治術(shù)時(shí)間至死亡或末次隨訪時(shí)間，以月為時(shí)間單位。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 軟件對(duì)患者一般資料及生化指標(biāo)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間對(duì)比采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示；計(jì)數(shù)資料的組間對(duì)比行卡方檢驗(yàn)，采用百分比(%)表示。以受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)確定血清指標(biāo)的最佳截?cái)嘀?，通過Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，采用Cox 回歸進(jìn)行多因素分析，以均數(shù)和95%可信區(qū)間(95% CI)表示。采用R 語言構(gòu)建Cox風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型列線圖，繪制ROC曲線、校準(zhǔn)曲線、臨床決策曲線評(píng)估預(yù)測(cè)模型，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般資料

兩組患者年齡、性別上差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，胃癌組血清CRP、PD-L1、Ang-2 濃度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，患者一般資料的比較見表1。

表1 患者一般資料的比較

2.2 術(shù)前血清指標(biāo)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

將納入的116 例患者術(shù)前血清CRP、PD-L1、Ang-2 濃度與患者臨床病理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性比較，分析顯示隨著年齡≥60 歲、腫瘤直徑≥5 cm、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、浸潤深度≥T3、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移度增加、分化程度降低，血清CRP、PD-L1、Ang-2 濃度上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在性別、腫瘤位置、TNM 分期上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，術(shù)前CRP、PD-L1、Ang-2 濃度與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系見表2。

表2 術(shù)前CRP、PD-L1、Ang-2濃度與患者臨床資料的關(guān)系

2.3 術(shù)前血清 CRP、PD-L1、Ang-2 濃度的 ROC 曲線分析

選取ROC曲線中約登指數(shù)最大值時(shí)的點(diǎn)為最佳截點(diǎn)，術(shù)前血清CRP濃度以19.53 mg/L為最佳截點(diǎn)，曲線下面積0.852[95% CI(0.761，0.934)，P<0.01]，靈敏度為95.17%，特異度為77.65%；術(shù)前血清PD-L1 濃度以42.80 pg/mL 為最佳截點(diǎn)，曲線下面積0.725[95% CI(0.648，0.837)，P<0.01]，靈敏度為 91.02%，特異度為61.93%；術(shù)前血清Ang-2濃度以305.16 μg/L為最佳截點(diǎn)，曲線下面積0.847[95% CI(0.702，0.915，P<0.01]， 靈 敏 度 為 94.28% ， 特 異 度 為68.04%，術(shù)前血清CRP、PD-L1、Ang-2 濃度的ROC曲線見圖1，ROC曲線分析見表3。

表3 術(shù)前血清CRP、PD-L1、Ang-2濃度的ROC分析

2.4 胃癌患者術(shù)前血清指標(biāo)與生存結(jié)局相關(guān)性分析

生存分析結(jié)果顯示，患者術(shù)前血清CRP 濃度<19.53 mg/L 時(shí)平均生存期較長，其1 年生存率為97.34%，高于≥19.53 mg/L 組患者的1 年生存率70.91%；患者術(shù)前血清PD-L1濃度≥42.80 pg/mL時(shí)平均生存期較長，其1 年生存率為95.86%，高于<42.80 pg/mL 組患者的1 年生存率71.24%；患者術(shù)前血清Ang-2濃度<305.16 μg/L時(shí)平均生存期較長，其1年生存率為94.58%，高于≥305.16 μg/L 組患者的1 年生存率76.17%，不同血清指標(biāo)分組患者的總體生存率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，胃癌患者術(shù)前血清指標(biāo)的單因素生存分析見表4，Kaplan-Meier法生存分析見圖2。

圖2 術(shù)前血清CRP、PD-L1、Ang-2濃度與胃癌患者總生存期的關(guān)系

表4 胃癌患者單因素生存分析(月)

2.5 術(shù)后生存影響因素Cox回歸分析

以胃癌患者的預(yù)后情況作因變量，以2.2 中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的病理指標(biāo)作為自變量，CRP 濃度<19.53 mg/L 賦值為 0，≥19.53 mg/L 賦值為 1；PD-L1濃度<42.80 pg/mL 賦值為0，≥42.80 pg/mL 賦值為 1；Ang-2濃度<305.16 μg/L賦值為0，≥305.16 μg/L賦值為1，進(jìn)行多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析。結(jié)果顯示，術(shù)前血清CRP和Ang-2濃度增高、術(shù)前血清PD-L1濃度降低、腫瘤直徑較大、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、浸潤較深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度較低均是導(dǎo)致胃癌患者發(fā)生不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，多因素Cox 回歸分析見表5。

表5 影響胃癌預(yù)后的多因素Cox回歸分析

2.6 預(yù)后模型的效能評(píng)價(jià)

采用R 語言中rms 包將多因素分析的獨(dú)立影響因素進(jìn)行擬合，構(gòu)建列線圖模型，以血清CRP、PD-L1、Ang-2 濃度構(gòu)建胃癌患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)列線圖(Nomogram)模型。模型顯示，術(shù)前血清CRP 濃度超過19.53 mg/L、術(shù)前血清PD-L1 濃度低于42.80 pg/mL、術(shù)前血清Ang-2 濃度超過305.16 μg/L、腫瘤直徑超過5 cm、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、浸潤深度超過T3、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移、低分化會(huì)提高胃癌患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)，Cox風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)列線圖模型見圖3。

圖3 胃癌Cox風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)列線圖模型

使用Bootstrap 法進(jìn)行預(yù)測(cè)模型的內(nèi)部驗(yàn)證，對(duì)模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的區(qū)分度進(jìn)行評(píng)估，胃癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的ROC 曲線見圖4A。校準(zhǔn)度評(píng)價(jià)顯示，Hosmer-Lemeshow 擬合優(yōu)度檢驗(yàn)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型預(yù)測(cè)概率較好擬合實(shí)際概率，校準(zhǔn)曲線見圖4B，圖中模型對(duì)1年生存率的預(yù)測(cè)值接近真實(shí)值，曲線貼近對(duì)角線。臨床決策曲線見圖4C，圖中顯示模型遠(yuǎn)離極端曲線，預(yù)測(cè)模型的臨床決策曲線閾值概率在1%~90%范圍內(nèi)時(shí)，凈獲益率>0，模型工作效果良好、有效性較高。

圖4 胃癌Cox風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的評(píng)價(jià)

3 討 論

胃癌是我國第二大常見腫瘤，易發(fā)于40 歲以上、幽門螺旋桿菌感染、既往慢性胃病、貧血、家族遺傳史、飲食不節(jié)等人群，近10年來隨著我國醫(yī)療水平的發(fā)展，胃癌死亡率下降約1.5%，但在全球范圍內(nèi)我國仍是胃癌大國，患者占50%左右[13]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，約1/3的患者在胃癌早期無腹痛、嘔吐、噯氣等明顯的消化系統(tǒng)病癥，常伴不明原因的食欲不振、消化不良、消瘦乏力等不適體征[14]。國家衛(wèi)健委提出癌癥防治方案以早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療為主，推薦高危人群每5年進(jìn)行1 次胃鏡篩查[15]。由于我國人口基數(shù)龐大，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)人群的內(nèi)鏡普查有諸多困難，因此制訂血清學(xué)篩查方法有助于胃癌早期風(fēng)險(xiǎn)的全民篩查，對(duì)癌前個(gè)體化評(píng)估、預(yù)后改善尤為重要。

我國消化病臨床研究中心專家認(rèn)為，以胃蛋白酶原Ⅰ(pepsinogenⅠ，PGⅠ)、胃蛋白酶原Ⅱ(pepsinogenⅡ，PGⅡ)、胃蛋白酶原比值(pepsinogen ratio，PGR)聯(lián)合胃泌素-17(gastrin-17，G-17)血清濃度檢測(cè)法構(gòu)建的評(píng)分系統(tǒng)是胃癌篩查和預(yù)后管理的有效方法，提出的“血清學(xué)新ABC法”得到了國內(nèi)外學(xué)者的高度認(rèn)可[16]。戚宇鋒等[17]對(duì)17 種細(xì)胞因子的血清濃度進(jìn)行高通量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中蛋白質(zhì)的代謝水平與健康對(duì)照組相比差異明顯；Tomoyuki 等[18]回顧研究表明，血清CRP聯(lián)合淀粉酶濃度可作為患者行胃癌根治術(shù)后發(fā)生腹腔內(nèi)出血等預(yù)后不良事件的預(yù)測(cè)指標(biāo)；Hagi 等[19]通過免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)PD-L1 是反映胃癌患者治療效果的有效生物指標(biāo)；Pereira 等[20]證明胃癌患者接受胃切除術(shù)后，PD-L1表達(dá)與患者生存和預(yù)后存在相關(guān)性；陳小華等[21]研究表明，在胃癌的靶向治療中抗血管生成療法應(yīng)用廣泛；Yoodee 等[22]發(fā)現(xiàn)Ang-2 分泌調(diào)控血管生成是腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志之一；Kallio等[23]通過小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ang-2阻斷劑可作用于腫瘤血管，對(duì)癌組織中異常管脈系統(tǒng)造成損傷從而抑制其生長。以上研究證實(shí)了CRP、PD-L1、Ang-2 濃度與胃癌預(yù)后存在相關(guān)性，是導(dǎo)致患者術(shù)后發(fā)生不良事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。血清CRP濃度升高在抑制機(jī)體免疫功能的同時(shí)加速腫瘤的發(fā)展，術(shù)前高濃度CRP 患者預(yù)后情況較差[24]；Ang-2 濃度升高可刺激腫瘤快速增生，術(shù)前血清Ang-2 濃度過高會(huì)增加癌癥轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)患者預(yù)后不利[25]；當(dāng)PD-L1 與受體高度結(jié)合時(shí)患者術(shù)前血清PD-L1濃度過低，機(jī)體抗腫瘤免疫作用較弱，加大患者預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)[26]。

綜上所述，胃癌根治術(shù)前患者血清CRP、PDL1、Ang-2 濃度與預(yù)后的相關(guān)性較高，除此之外，腫瘤直徑超過5 cm、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、浸潤深度超過T3、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移、低分化也是患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。相比于傳統(tǒng)的標(biāo)志物及其聯(lián)合，血清CRP、PD-L1、Ang-2 濃度無論是敏感性、特異性、準(zhǔn)確性方面均有大幅度提高，對(duì)于胃癌的篩查和早期診斷具有較高的臨床價(jià)值；基于多因素Cox 分析構(gòu)建列線圖模型，將回歸方程通過圖形進(jìn)行展示，使得結(jié)果更具有可讀性，列線圖直觀、便于理解的特點(diǎn)更有助于指導(dǎo)臨床決策。但本研究尚存在一定的局限性，首先，納入的樣本量較少且數(shù)據(jù)來自單一中心，增加了選擇偏倚的風(fēng)險(xiǎn)；其次，對(duì)于我國以外的其他種族人群，尚未進(jìn)行本研究成果合理性和有效性探討，未來還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心、前瞻性研究。隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，血清學(xué)檢測(cè)在胃癌篩查和預(yù)后方面將更加成熟，期待國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)一步的臨床研究，為胃癌患者個(gè)體化預(yù)后方案提供更多的理論依據(jù)。