郭德志，張建鵬

（1.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)員三大隊(duì)八隊(duì)，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200433)

近10 年來惡性腫瘤的發(fā)病率保持每年約3.9%的增幅，死亡率保持每年2.5%的增幅，引起了人們的高度重視[1]。對于多數(shù)惡性腫瘤而言，外科治療、放射治療、化學(xué)治療、靶向治療以及免疫治療等方法可以殺死患者體內(nèi)的大部分腫瘤細(xì)胞，卻難以從根本上治愈癌癥。這一現(xiàn)象可以用腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)理論加以解釋。CSCs 具有自我更新、無限增殖和抗化學(xué)毒物損傷的能力，與腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有著極為密切的關(guān)系。CSCs有5個(gè)獨(dú)立的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，包括自我更新能力，占總腫瘤種群的小部分，可復(fù)制的腫瘤表型，向非致瘤細(xì)胞的多潛能分化能力，以及獨(dú)特的細(xì)胞表面抗原表型[2]。近年來，CSCs 在各種腫瘤中不斷被發(fā)現(xiàn)，例如前列腺癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等。對CSCs 的研究和靶向療法的嘗試，均印證了該學(xué)說[3-7]。如果能從腫瘤細(xì)胞中分離、培養(yǎng)CSCs，建立可靠的腫瘤模型，則有助于揭示CSCs 的功能特性和腫瘤發(fā)生機(jī)制，進(jìn)而靶向消除干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞群，將有望成為治療惡性腫瘤的有效策略之一。因此，本文主要對CSCs的常用培養(yǎng)和分選鑒定方法及其原理進(jìn)行綜述，并對各類方法進(jìn)行總結(jié)和對比。

1 CSCs的培養(yǎng)方法

1.1 非黏附培養(yǎng)系統(tǒng)

非黏附培養(yǎng)系統(tǒng)是將細(xì)胞系培養(yǎng)在具有非黏附表面的培養(yǎng)塑料制品中。一般采用在培養(yǎng)皿上涂覆瓊脂糖薄膜的方式使細(xì)胞懸浮，或者采用胰酶解離貼壁細(xì)胞后再種植在DMEM培養(yǎng)基上的方法[8]。通常非黏附條件下生長的細(xì)胞球失去錨固，黏附分子通過信號傳遞途徑影響細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，較易導(dǎo)致凋亡反應(yīng)。而對于CSCs 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞球體處于惡劣環(huán)境時(shí)可以通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，激發(fā)其表達(dá)相關(guān)特性的潛力，從而得到富集培養(yǎng)的細(xì)胞球。相比于需要2~6 周的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，非黏附培養(yǎng)系統(tǒng)5~7 d 內(nèi)可生成球體，具有良好的時(shí)效性；并且這種改良的非黏附性培養(yǎng)系統(tǒng)不需要添加生長因子，成本效益高[9]；同時(shí)，相比于貼壁的細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞球的集落形成能力、自我更新能力、細(xì)胞侵襲力、化療耐藥性和可能的干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)均顯著增加[8，10]。

1.2 三維(3D)培養(yǎng)系統(tǒng)

非干細(xì)胞樣癌細(xì)胞似乎可自發(fā)地重新轉(zhuǎn)變?yōu)楦杉?xì)胞樣癌細(xì)胞[11]。研究表明，來自人結(jié)腸癌患者的小部分無干細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞亞群可表現(xiàn)出非隨機(jī)的自我更新能力和致瘤性[12]。因此，基于CSCs標(biāo)志物的培養(yǎng)方法并不可靠[13]。

目前，培養(yǎng)扁平單層細(xì)胞的二維(2D)平臺仍然是細(xì)胞測定研究最常用的培養(yǎng)方法。2D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)簡單、方便、經(jīng)濟(jì)高效且應(yīng)用廣泛。但是，傳統(tǒng)2D 培養(yǎng)的局限性無法模擬體內(nèi)結(jié)構(gòu)，與真實(shí)微環(huán)境差別較大的2D 環(huán)境可能在癌細(xì)胞對抗癌藥物的預(yù)測實(shí)驗(yàn)中造成誤導(dǎo)性結(jié)果[14]。原因在于實(shí)體腫瘤以3D構(gòu)象生長，即實(shí)體腫瘤周圍環(huán)繞著各種非腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。在這些條件下，腫瘤細(xì)胞往往暴露于次優(yōu)生長條件下，如缺氧或低營養(yǎng)水平，并受到細(xì)胞間接觸抑制或來自周圍腫瘤和非腫瘤細(xì)胞的各種信號的影響[15]。因此，3D培養(yǎng)系統(tǒng)在研究癌細(xì)胞的生長、增殖、分化、轉(zhuǎn)移及腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)等方面顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢[16]。于是出現(xiàn)了用軟三維(3D)纖維蛋白凝膠選擇和培養(yǎng)CSCs的機(jī)械方法。研究顯示，機(jī)械力可以調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的分化和自我更新，腫瘤細(xì)胞的分化能力也與培養(yǎng)基質(zhì)的剛性有關(guān)[17-18]。因此，使用軟基質(zhì)的機(jī)械策略可從癌細(xì)胞選擇CSCs。3D 培養(yǎng)系統(tǒng)比單層培養(yǎng)物更有效地模擬組織樣結(jié)構(gòu)，在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及卵巢癌中均已被應(yīng)用[19-20]。3D培養(yǎng)系統(tǒng)包括多細(xì)胞球體形成(液體覆蓋培養(yǎng)和懸掛液滴法)、水凝膠培養(yǎng)、生物反應(yīng)器培養(yǎng)、生物打印和支架培養(yǎng)。雖然每種3D培養(yǎng)的技術(shù)和方案不同，但其目的均盡可能模擬細(xì)胞在真實(shí)情況下的微環(huán)境。

相比于傳統(tǒng)的2D 纖維蛋白底物，3D 軟纖維蛋白凝膠具有“激發(fā)效應(yīng)”，使培養(yǎng)出的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的致瘤性，例如在阿霉素或順鉑培養(yǎng)條件下不易凋亡；能培育出體積相對較大的球狀體并更快地生長；將腫瘤細(xì)胞球接種到小鼠體內(nèi)，表現(xiàn)出更高的致瘤能力，細(xì)胞球能在惡劣環(huán)境中存活并且大多數(shù)最終長成大腫瘤。而且相比于根據(jù)標(biāo)志物分選出的CD133+、CD44+細(xì)胞，該方法培養(yǎng)出的細(xì)胞更易形成腫瘤?？傊?D軟纖維蛋白凝膠憑借其相對于癌細(xì)胞剛度的柔軟性，可以控制癌細(xì)胞亞群的分化行為和增殖速度，因此這種方法多用于培養(yǎng)、選擇目標(biāo)細(xì)胞系中，且此方法不依賴于干細(xì)胞標(biāo)志物[13]。

1.2.1 支架培養(yǎng)3D 支架通常是由多種材料構(gòu)成的天然或合成3D 結(jié)構(gòu)，不同支架具有不同的孔隙率、滲透率、表面化學(xué)和機(jī)械特性，會對細(xì)胞培養(yǎng)造成不同的影響。它們主要用于模仿某種特定細(xì)胞類型在特定組織的體內(nèi)微環(huán)境。因此，天然或合成的水凝膠是支架的理想材料[21]。但水凝膠一般價(jià)格昂貴，另一種選擇則是與其他支架產(chǎn)品一起使用，比如合成的納米纖維材料[22]。有研究表明，間距為50 μm、孔隙率為1∶2的單層支架效果最佳[23]。需要注意的是，支架培養(yǎng)的三維模型構(gòu)建需要較高成本，且不同批次的三維支架重復(fù)性低[19]。

1.2.2 懸滴技術(shù)懸掛液滴(簡稱懸滴)技術(shù)相對簡單且適用于許多細(xì)胞系，幾乎每個(gè)液滴均可以生成一個(gè)3D 球體。懸滴技術(shù)最初在培養(yǎng)皿蓋中進(jìn)行，方法是將少量具有特定細(xì)胞密度的細(xì)胞懸浮液(15~30 μL)滴落到蓋子上，隨后倒置，由于表面張力而將等分試樣的細(xì)胞懸浮液變成懸掛滴劑而不會滴落。因此，細(xì)胞被迫積聚在液滴的底部，液-空氣界面處，并進(jìn)一步聚集和增殖，直到形成球體[14]。后來，有了代替培養(yǎng)皿板的懸掛式滴板。由于滴板與液體處理器系統(tǒng)、高通量加樣設(shè)備均能兼容，使其操作起來更加簡單，且每塊板可以生產(chǎn)更多的3D球體，但價(jià)格昂貴[21]。

1.2.3 生物反應(yīng)器生物反應(yīng)器3D 培養(yǎng)系統(tǒng)的一般原理是，通過輕輕攪拌，旋轉(zhuǎn)腔室或使用泵系統(tǒng)通過支架灌注培養(yǎng)基，將具有最佳細(xì)胞密度的細(xì)胞懸浮液通過連續(xù)攪拌填充到腔室中。生物反應(yīng)器配有介質(zhì)流動(dòng)系統(tǒng)，以提供營養(yǎng)循環(huán)，排出代謝廢物，且生物反應(yīng)器內(nèi)物理和化學(xué)因素具有均勻性[14]。因此，基于生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)模型適用于密集的細(xì)胞擴(kuò)增和大規(guī)模生物分子生產(chǎn)，例如抗體或生長因子。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于能夠精確和可重復(fù)地控制細(xì)胞培養(yǎng)所需的許多環(huán)境條件，能夠在生長過程中維持和監(jiān)測環(huán)境[19，24]。

培養(yǎng)CSCs 的要點(diǎn)是需基于其生長特性進(jìn)行培養(yǎng)的；關(guān)鍵點(diǎn)在于如何模擬TME；難點(diǎn)在于如何建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)條件，如何防止CSCs 的分化；而如何讓培養(yǎng)方法操作簡單、成功率高、便于推廣，需要更進(jìn)一步探究。值得注意的是，上文只是闡述了CSCs 的培養(yǎng)方法，不同來源的腫瘤特性不同，培養(yǎng)條件也不完全相同，在實(shí)際操作中需要經(jīng)過摸索才能針對不同的CSCs建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)條件。

2 CSCs分選鑒定方法

鑒定方法通常為免疫組化染色、RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈 反 應(yīng) (reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)以及體內(nèi)致瘤性研究。除此之外，還有Western blot、化學(xué)敏感性和放射敏感性測定、血細(xì)胞比容分析、cDNA 微陣列分析等方式。在目前的研究中，CSCs的分離鑒定并不是采用單一的方法，而是選用多種方法聯(lián)合以獲得純度更高的CSCs。

2.1 側(cè)群細(xì)胞分選法

側(cè)群細(xì)胞(side population，SP)又稱邊緣細(xì)胞，其特點(diǎn)是可以將進(jìn)入細(xì)胞核的熒光染料Hoechst33342排出胞外，在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀檢測時(shí)表現(xiàn)為不著色。這類細(xì)胞是1996 年Goodell 等在用Hoechst33342 染色法研究骨髓時(shí)發(fā)現(xiàn)的，他們將其命名為SP 細(xì)胞。而隨著對SP 細(xì)胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞可發(fā)生不對稱分裂、具有自我更新等功能[25]，這些特性與CSCs一致，所以通過分選SP細(xì)胞，可達(dá)到富集CSCs的效果。目前已證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞系中存在SP細(xì)胞，例如在上皮性卵巢癌細(xì)胞系中SP 細(xì)胞占比0.5%，人結(jié)腸直腸癌組織中SP 細(xì)胞的比例為0.90%，胃癌BGC-823 細(xì)胞株中的SP 細(xì)胞約占2%，大腸癌細(xì)胞系Lovo中約含0.54%~0.62%[26-29]。

一種方法是應(yīng)用無血清培養(yǎng)液(serum-free media，SFM)分離SP 細(xì)胞：①將需要培養(yǎng)SP 細(xì)胞的細(xì)胞系在傳統(tǒng)血清培養(yǎng)基(serum-supplemented media，SSM)中傳代；②選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞，清洗后經(jīng)胰酶消化并計(jì)數(shù)，重懸于SFM中，接種于孔板繼續(xù)培養(yǎng)；③待增殖形成細(xì)胞球3~4 d 后，再進(jìn)行重懸傳代。如此反復(fù)，在SSM和SFM培養(yǎng)基中交替培養(yǎng)，其中能形成致密形態(tài)一致的腫瘤球且傳代后腫瘤球的總數(shù)大量擴(kuò)增的這部分腫瘤球細(xì)胞，即為SP細(xì)胞[29]。

根據(jù)SP細(xì)胞能夠?qū)晒馊玖螲oechst33342泵出細(xì)胞外而使細(xì)胞呈弱熒光信號這一特性，還可以使用流式細(xì)胞分選技術(shù)分選SP細(xì)胞[30]。進(jìn)行2~3次分選，分析SP細(xì)胞比例變化，直至能夠獲得穩(wěn)定比例的SP細(xì)胞[26]。此方法優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，但是分離效率低，且染料有一定的細(xì)胞毒性，影響細(xì)胞活性。

SP 細(xì)胞分選法主要用于富集耐藥性強(qiáng)的CSCs，因此，在研究新型藥物對CSCs 的殺傷效果時(shí)，常用此方法富集細(xì)胞。例如，研究肉桂醛對胰腺癌細(xì)胞的作用，研究靈芝烯酸B對胃癌細(xì)胞的作用以及槐耳對肝癌細(xì)胞的作用等均采用的SP細(xì)胞分選法[30-32]。但需要注意的是，SP 細(xì)胞并不一定等同于CSCs 本身[33-34]。對于不同類型的腫瘤，SP 細(xì)胞分選培養(yǎng)法能否適用，仍需要進(jìn)一步研究。

2.2 藥物選擇分離

根據(jù)CSCs 假說，CSCs 的基本特性是對化療具有抗性。由于這種特征，CSCs 可以在治療過程中存活并再生腫瘤。因此，使用特定藥物例如紫杉醇和順鉑培養(yǎng)細(xì)胞，輔以表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、白血病抑制因子、胰島素或標(biāo)準(zhǔn)含血清系統(tǒng)，在藥物選擇和無血清培養(yǎng)系統(tǒng)下形成的非貼壁細(xì)胞球，對順鉑、紫杉醇、阿霉素和甲氨蝶呤的耐藥性更強(qiáng)[35]。

具體方法為：先在無順鉑的培養(yǎng)液中培養(yǎng)對數(shù)生長期的細(xì)胞，傳代后依次遞增順鉑濃度誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥，最后得到穩(wěn)定生長且可傳代的耐藥細(xì)胞即為干細(xì)胞[36]?？上韧ㄟ^細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)CCK-8 或MTS 法計(jì)算藥物抑制率IC50，進(jìn)行初步檢驗(yàn)，再通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot 等方法，檢測腫瘤干性相關(guān)基因的表達(dá)水平，對篩選獲得細(xì)胞的干性進(jìn)行驗(yàn)證[36]。結(jié)果表明，在低濃度或高濃度下應(yīng)用連續(xù)或多步驟藥物選擇建立的多藥耐藥癌細(xì)胞系，即使在體外長期培養(yǎng)，或在不同條件下培養(yǎng)數(shù)年甚至數(shù)十年，其腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物中仍然擁有少量致瘤細(xì)胞，這進(jìn)一步證明了其具有干性[37]。

2.3 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

通常利用商品化的試劑盒提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來對樣本進(jìn)行定量分析，用于分析mRNA的PCR引物可以是GAPDH，或者其他保守序列。MYC、OCT4、SOX2、Nanog 幾乎在各類CSCs 中均呈現(xiàn)過表達(dá)，可作為分析基因[38]。用該方法分析的基因最好是：①包括CSCs分子標(biāo)記和調(diào)節(jié)CSCs 增殖，自我更新和多能性的基因，以幫助確保CSCs分離株在培養(yǎng)物中的穩(wěn)定性；②包括參與CSCs 不對稱細(xì)胞分裂、遷移和轉(zhuǎn)移的基因，以及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以幫助促進(jìn)CSCs表征以及目前正在測試的治療劑的靶標(biāo)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)

與正常癌細(xì)胞不同，CSCs 具有獨(dú)特的細(xì)胞特征。其中，CD133、CD44 和上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)等是常用且適用于大多數(shù)CSCs 鑒定的非特異性標(biāo)志物[34]。乳腺癌干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物主要為CD29 和CD90 等；肝癌干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物是CD90 和CD13；頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的干細(xì)胞標(biāo)志物為CD271；子宮內(nèi)膜癌的干細(xì)胞標(biāo)志物CD117；胰腺癌CSCs的特殊標(biāo)記物為CD24[39-43]。根據(jù)特定的標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)可對細(xì)胞表面標(biāo)志物陽性和陰性的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分選。因?yàn)镃SCs 在腫瘤細(xì)胞中相當(dāng)稀少，所以該分選方式需要獲得大量備選的腫瘤細(xì)胞。在分選陽性比例很低的CSCs時(shí)，還經(jīng)常聯(lián)合使用陽性分選和陰性分選，以得到高純度的CSCs。此外，氧含量影響干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)物也可能影響CD133+細(xì)胞的表達(dá)，因此，需要考慮實(shí)驗(yàn)程序是否可能會影響后續(xù)研究及CSCs的產(chǎn)量[44]。

2.4.1 熒光激活細(xì)胞分選熒光激活細(xì)胞分選(fluorescenceactivated cell sorting，F(xiàn)ACS)是一種成熟的方法。首先將熒光標(biāo)記的抗體與CSCs 表面的標(biāo)記結(jié)合，再將細(xì)胞以流注的形式通過細(xì)胞分選器。在出口，熒光被激光所激發(fā)，發(fā)射的熒光信號通過光電倍增管放大，帶有不同熒光標(biāo)記的細(xì)胞被分離，即可分選出CSCs[34]。

FACS 的優(yōu)勢在于多個(gè)標(biāo)記可以同時(shí)排序，并且具有高特異性。同時(shí)，F(xiàn)ACS 可檢測的特征不僅局限于表觀特征，而且可檢測細(xì)胞信號通路的活性和蛋白質(zhì)的相互作用，這很好的解決了實(shí)體瘤干細(xì)胞缺乏膜抗原的問題。但FACS 設(shè)備價(jià)格昂貴且對無菌條件的要求很高，因此，建議在培養(yǎng)基中加入青霉素和鏈霉素。另外，噴嘴尺寸會影響分選的速度，應(yīng)選取CSCs直徑4~5倍即85~100 μm的噴嘴；為避免分選時(shí)間過長導(dǎo)致細(xì)胞活力降低，細(xì)胞應(yīng)以每毫升1×107~2×107個(gè)的濃度重懸[44]。

2.4.2 磁激活細(xì)胞分選磁激活細(xì)胞分選(magnetic-activated cell sorting，MACS)是一種簡單高效的方法。在能與表面標(biāo)記結(jié)合的抗體上附加磁珠，當(dāng)腫瘤細(xì)胞通過置于磁場中的分離柱時(shí)，與磁珠結(jié)合的細(xì)胞通過磁力被保留在分離柱的內(nèi)表面，未結(jié)合的細(xì)胞則通過分離柱。隨后，可以從柱中洗脫表面標(biāo)記陽性細(xì)胞。

由于磁珠由氧化鐵和多糖涂層制成，且體積微小隨時(shí)間會被去除，其對細(xì)胞活力的影響很小，因此該方法適合大量細(xì)胞分選。盡管如此，該方法的應(yīng)用依舊受到限制：一是分選前的處理比較耗時(shí)；二是分選設(shè)備和磁珠價(jià)格昂貴，磁珠不能重復(fù)使用；三是該方法每次分選只能依賴于單個(gè)膜抗原，而實(shí)體瘤干細(xì)胞卻常常缺乏膜抗原的表達(dá)[44]。

2.5 Western blot檢測

該方法作為傳統(tǒng)的分選鑒定方法，簡單方便且普適性高，基本適用于所有類型的CSCs。同時(shí)，其高度的靈敏性降低了實(shí)驗(yàn)成本。但是，如果操作不當(dāng)，容易造成產(chǎn)生多個(gè)譜帶、褪色等問題，得到假陽性或假陰性反應(yīng)。該方法可作為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分析鑒定分選結(jié)果。

3 小 結(jié)

由于CSCs 的定義還不夠明確，只能根據(jù)其特性對CSCs 加以判斷，目前仍無標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)方法，因此需要多種方法配合使用才能得到相對理想的干細(xì)胞。同時(shí)，選擇分離方法時(shí)，需要從研究目的、實(shí)驗(yàn)成本和實(shí)驗(yàn)流程等角度來考量。此外，通過上述總結(jié)，不難發(fā)現(xiàn)CSCs 的培養(yǎng)和鑒定方法在過去的研究中有了顯著進(jìn)步，但仍舊存在許多問題：懸浮培養(yǎng)法導(dǎo)致細(xì)胞粘貼在一起，難以獲得單克隆細(xì)胞；培養(yǎng)周期長，導(dǎo)致細(xì)胞失去干性；標(biāo)記SP群的染料有毒，影響細(xì)胞活力。從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，那些高效的方法成本往往較高。從臨床的角度考慮，為了在手術(shù)中可視化CSCs，也需要尋找更特異、無毒的CSCs 染料。同時(shí)，需要制定用于分離和富集CSCs 的標(biāo)準(zhǔn)化方案。最后，在此基礎(chǔ)上，需要對干細(xì)胞標(biāo)志物和相關(guān)通路進(jìn)行進(jìn)一步的探索。比如，在研究中發(fā)現(xiàn)有些培養(yǎng)方式下的干細(xì)胞會表達(dá)Sox2，這可能對CSCs在體內(nèi)的自我更新和生長至關(guān)重要。還有一些標(biāo)志物是異常信號通路的一部分，會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療產(chǎn)生耐藥性。這些研究可以促使靶向藥物的研發(fā)，從而解決臨床腫瘤的耐藥復(fù)發(fā)等問題。