鄧會巖，劉 暢，賈 迎，李 芳，尹丹靜，檀紫瑞，蘇 冰，劉月平，*

(1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院病理科，河北石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外科，河北 石家莊 050011；3.河北省寧晉縣婦幼保健院，河北 邢臺 055550)

目前，肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內的腫瘤疾病中居首位，且發(fā)病率仍有逐年上升的趨勢，我國亦不例外，全球癌癥數據表明，肺癌導致的死亡占總體癌癥死亡人數的18.0%[1-2]。非小細胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數的85%，大多數NSCLC患者發(fā)現時即為晚期或已出現轉移。近年來，肺腺癌發(fā)病率已超過鱗狀細胞癌[3]。放化療是最常用于局部晚期或晚期NSCLC 的治療方法，它可以一定程度地改善癥狀、延長生存期，但存在腫瘤進展快、藥物副作用大等缺點。隨著目前分子檢測技術的廣泛開展，腫瘤的分子生物學檢測和靶向治療為患者提供了新的治療策略。

NSCLC 中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突變的發(fā)現引導了一種新的治療模式[4]。針對有EGFR基因突變的肺腺癌患者，診斷、治療和臨床預后有別于非EGFR基因突變的患者，EGFR基因突變患者進行酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)治療，對于延長患者生存期及改善患者生存質量都具有顯著的指導意義[5]。組織活檢是進行EGFR基因檢測的金標準，可進一步提供有關腫瘤遺傳特征的信息，有助于確定可接受治療的患者[6]。然而，臨床上組織樣本取材困難，二次取材活檢更是無法實現[7]。此時，外周血及胸水是一種存在于實性腫瘤組織外，可用于EGFR基因檢測的腫瘤成分。外周血循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)可提供與侵入性腫瘤活檢組織相似的分子遺傳信息，通常被稱為“液體活檢”，可用于療效監(jiān)測、早期輔助診斷及腫瘤進展與不良預后的早期預警[8]。除此之外，聯合胸水及胸水沉渣細胞檢測已成為檢測NSCLC 患者EGFR突變的幾種新的、有前景且侵入性較小的補充方式，均是目前臨床常用的檢測手段。

本研究回顧分析收治的175 例肺腺癌患者，均為Ⅲ和Ⅳ期患者病例，所有病例均通過突變擴增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)-聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)方法進行了EGFR基因突變檢測，并對比不同樣本間的檢測結果。為進一步提升肺腺癌患者的EGFR突變檢出率，更多地篩選出適合靶向治療的患者提供了依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2016年7月—2017年12月在河北省腫瘤醫(yī)院呼吸內科和腫瘤內科收治的Ⅲ~Ⅳ期肺腺癌住院和門診病例175 例，本研究所有病例均取得患者知情同意及通過倫理審查(2020KY314)。所有患者均經病理證實為肺腺癌(131例患者經組織病理證實為肺腺癌，其中119 例患者經組織活檢樣本證實，12 例患者經胸水沉渣細胞樣本證實，44例患者經氣管鏡刷片細胞病理證實)。175 例均有血漿樣本，其中119 例同時有活檢組織樣本，12例同時有胸水沉渣細胞樣本。男48例，女127 例，年齡39~82 歲，平均年齡63 歲，中位年齡54歲。臨床分期Ⅲ期74例，Ⅳ期101例。

1.2 試劑與儀器

核酸提取試劑盒、EGFR基因突變檢測試劑盒和熒光定量PCR儀均購于美國羅氏公司。其他主要儀器包括賽默飛Biofuge Primor 低溫離心機，蔡司Scope A.1光學顯微鏡。

1.3 血漿標本采集與血漿游離DNA提取、擴增

經靜脈采集患者外周血液5 mL，置入EDTA抗凝離心管，按照核酸提取試劑盒操作說明提取游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)，提取完畢后測定DNA 濃度，并以此cfDNA 為模板，按EGFR基因突變檢測試劑盒說明書進行EGFR基因19~21外顯子突變檢測。

1.4 肺癌組織標本DNA提取與擴增

肺癌活檢組織樣本和胸水沉渣細胞樣本均進行福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffinembedding，FFPE)，經診斷確診后，將FFPE 組織按照5 μm 厚度連續(xù)切片10張，并將切取的組織片置于1.5 mL有蓋無菌微量離心管中，按照核酸提取試劑盒操作說明提取DNA(脫蠟、消化裂解、吸附核酸、洗滌純化、洗脫DNA)，提取完畢后測定DNA 濃度，并以肺癌組織樣本基因組DNA為模板，后續(xù)提取與擴增過程同步驟1.3。

1.5 胸水沉渣細胞樣本DNA提取與擴增

胸腔積液脫落細胞學病理證實為腺癌的患者，另取積液1.5 mL 置于有蓋無菌微量離心管中，室溫10 000 r/min 離心3 min，棄上清。向沉淀中加入1 mL 1×PBS混勻后室溫10 000 r/min離心3 min，棄上清，獲得最終細胞沉淀，并制作成FFPE 樣本塊，后續(xù)提取與擴增過程同步驟1.4。若收集的細胞沉淀中有大量的紅細胞殘留，可加紅細胞裂解液混勻后，室溫放置5 min，10 000 r/min 離心3 min，棄上清，收集細胞沉淀，可重復幾次直至紅細胞去除干凈。

1.6 隨 訪

所有患者進行電話方式隨訪，隨訪截至2018 年5月31 日，失聯病例計為失訪，共73 例失訪病例?？偵鏁r間為從確診到死亡或末次隨訪時間，以月為單位。中位隨訪時間13個月。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0對數據進行統(tǒng)計學分析，患者不同臨床病理指標組患者血液EGFR突變率的差異采用卡方檢驗，血液樣本和組織樣本EGFR突變率的比較采用Fisher精確概率法，將卡方檢驗中與EGFR突變相關的諸因素納入Cox 回歸進行患者臨床病理指標與生存時間之間的多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 NSCLC患者臨床病理特征

175 例患者均為晚期肺癌患者，均進行ctDNAEGFR突變檢測，檢測成功率為100%(175/175)。119例患者同時進行組織活檢樣本EGFR基因檢測，12 例患者同時進行胸水沉渣細胞樣本EGFR基因檢測，但樣本檢測成功率為96.9%(127/131)，失敗樣本均為胸水沉渣細胞樣本，其中1 例為樣本DNA 質量差，3 例為提取樣本DNA濃度<2 ng/μL，低于上樣濃度。不管是血液樣本還是組織樣本，EGFR突變均以Exon19 del 和Exon21 L858R 為主，兩者突變率的總和分別占血液樣本和組織樣本總突變率的83.0%和81.7%，不同樣本間EGFR突變分布見表1。48 例無組織樣本或組織樣本檢測不成功的患者中，其中10 例血液樣本EGFR檢測為陽性。在175 例晚期非小細胞肺癌患者中，59/175 例(33.7%)存在血液樣本EGFR檢測陽性，60/127 例(47.2%)存在組織樣本EGFR突變陽性。晚期非小細胞肺癌EGFR突變在不同的性別(χ2=3.451，P=0.045)、 腫 瘤 直 徑 (χ2=8.911，P=0.002)、 T 分 期 (χ2=17.567，P=0.000)、 淋 巴 結 轉 移 (χ2=18.511，P=0.000)、轉移站數(χ2=3.341，P=0.047)和遠處轉移(χ2=10.874，P=0.001)的分組間的差異有統(tǒng)計學意義。各臨床病理指標與EGFR突變之間的關系見表2。

表1 不同樣本間EGFR突變分布[百分率(各位點陽性例數/總陽性例數)]

表2 175例肺腺癌患者臨床病理特征及與血液樣本EGFR突變關系

2.2 血液樣本與組織樣本EGFR突變對比分析

127 例患者同時進行了肺癌血液樣本和組織樣本EGFR檢測，通過表1中對比血液樣本和組織樣本檢測EGFR突變狀態(tài)總體一致性為85.0%(108/127)，即45例患者血漿EGFR檢測與組織樣本EGFR檢測結果均為EGFR檢測陽性；而63 例患者兩種樣本EGFR檢測均為陰性。4 例患者僅在血液EGFR檢測中為陽性；15例患者僅在組織樣本EGFR檢測中為陽性。未經組織檢測或組織檢測不成功的48 例患者中，經血液EGFR檢測，10 例患者為陽性，其余均為陰性。采用Fisher精確概率法將血液和組織兩組樣本EGFR突變率進行比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。各組間的突變率見表3。

表3 血液樣本和組織樣本EGFR突變率對比

2.3 生存分析

血漿DNA 中存在EGFR檢測陽性的患者，其無進展生存期比陰性的患者更長。EGFR檢測陽性患者中位無進展生存期為5.7個月，而EGFR檢測陰性患者中位無進展生存期為 2.8 個月(χ2=8.943，P<0.05)。在患者臨床病理指標與生存時間的分析中，腫瘤直徑[95%CI(0.151， 0.725)，P=0.006]、 淋 巴 結 轉 移 [95%CI(0.180， 0.865)，P=0.020]、 遠 處 轉 移 [95%CI(0.097，0.612)，P=0.003]均是影響患者無進展生存期的重要因素。各組間的生存期分析見表4。

表4 患者臨床病理指標與生存時間的多因素分析結果

3 討 論

EGFR信號通路作為腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的通路之一，在調節(jié)細胞分裂、活化、凋亡等多種生物學事件中起到關鍵作用。異常的EGFR基因活化，可以抑制腫瘤細胞凋亡，促進細胞增殖、分化、遷移，甚至新生血管生成[9]。我國晚期肺腺癌EGFR基因陽性率在40%~60%之間，在當今精準化醫(yī)療的時代，EGFR突變陽性對于晚期肺癌患者來說意義重大。目前，此類患者可采用基于EGFR基因的靶向藥物如厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gifitinib)和奧沙替尼(osimertinib)進行治療。但靶向藥物的應用、療效以及是否存在耐藥均需要通過評估EGFR基因突變狀態(tài)來實現。因此，如何選取檢測樣本，以及如何采用靈敏度高、準確性好的檢測方法將此類患者檢測出基因變異，從而篩選出可用藥患者是當今精準治療的重中之重。

研究顯示[10]，大部分晚期NSCLC 患者的血液中存在循環(huán)游離DNA(cell free DNA，cfDNA)。cfDNA主要來源于凋亡或壞死的細胞，包括正常細胞和腫瘤細胞，如果來自腫瘤細胞稱為ctDNA。血液游離DNA片段通常較短，在晚期癌癥患者血液中濃度極低，平均約為17 μg/L。既往系列研究已經在NSCLC 患者的血漿或血清樣本ctDNA 中發(fā)現EGFR基因突變，初步顯示外周血ctDNAEGFR基因突變檢測及對EGFR-TKIs療效預測的可行性[10-11]。此外，NSCLC 患者在TKI 治療過程中會發(fā)生耐藥，甚至有文獻報道過多次藥物敏感、耐藥交替出現[10-11]。因此，在腫瘤不同時期、治療的不同階段利用便捷的血液EGFR基因檢測，動態(tài)監(jiān)測EGFR突變狀態(tài)，調整治療方案，合適的時間將合適藥物用在合適的患者身上，實現精準醫(yī)療。

國內部分專家曾就檢測EGFR基因突變的規(guī)范提出了建議[12]。建議指出肺癌組織樣本如手術標本、活檢標本、胸水沉渣細胞標本和血液標本均是晚期NSCLCEGFR突變狀態(tài)檢測可選擇的樣本[13-14]。本研究比較了血液樣本和肺癌組織樣本EGFR基因突變的異同，結果顯示了肺癌組織樣本和血液樣本的EGFR基因檢測結果存在小部分病例間的差異，且肺癌組織樣本的陽性率高于血液，以及存在單純血液樣本EGFR為突變型而肺癌組織樣本為野生型的病例，這些差異可能反映了血液DNA檢測技術的局限性和腫瘤內的異質性，同樣也可能預示了對化療/靶向治療的敏感性差異。但盡管這種異質性在許多癌癥尤其是在非小細胞肺癌中是已知的，但一個臨床決定通常僅基于一次活檢，由于血液反映了整個連續(xù)的腫瘤負荷，因此，使用血漿DNA 進行EGFR突變檢測可能更為準確并且信息量大。在肺癌組織樣本中，除了納入活檢組織樣本，本研究還納入了胸水沉渣細胞樣本，此類樣本在臨床工作中同樣為常見樣本，本組12例胸水沉渣樣本EGFR突變率為37.5%，雖然陽性率略低于活檢組織樣本和血液樣本，但是無疑是一種行之有效的檢測手段，在活檢組織樣本取材困難且存在大量癌性胸水的病例中，采用胸水沉渣細胞進行EGFR基因檢測是一種很好的檢測方法。此類樣本除滿足臨床診斷的需求外，在進行EGFR基因檢測時同樣會面臨樣本量不足、處理不良導致DNA 降解等問題，本組12 例胸水沉渣樣本中4 例檢測失敗，其中1 例為樣本DNA 質量差，3 例為提取樣本DNA 濃度低于上樣濃度，此類問題雖然在本組研究中均出現在胸水沉渣樣本中，但在其他樣本中同樣常見，應盡可能地避免此類問題的出現，進而提升EGFR突變檢出率。

眾所周知，在TKIs治療的患者中，在預處理標本中不能檢測到的引起TKI 抗性的突變可能會在患者中復發(fā)，如T790M突變，T790M突變是EGFR-TKIs治療過程中最常見的耐藥突變。AURA 研究顯示，osimertinib 對血漿中T790M 陽性和在活檢組織中T790M陰性患者的療效低于T790M組織檢測陽性的患者。目前的臨床實踐表明[15]，由于T790M 在腫瘤組織中存在異質性，因此需要在復發(fā)部位進行再次活檢以預測osimertinib 的治療效果?？傊?，血液標本和組織標本互為補充，在組織標本EGFR檢測為野生型時，或者無法獲得組織樣本時，均有必要對血液標本進行EGFR檢測，以提高EGFR基因的檢出率，擴大TKIs適用人群。

Thress 等[16]報道，胸外轉移性患者比胸腔內轉移患者的血漿中更容易檢測到EGFR基因突變，且EGFR陽性組出現轉移的數量明顯高于陰性組。這表明腫瘤轉移狀態(tài)可能影響血漿中EGFR是否突變，需在臨床工作中進一步驗證，此研究結果與我們的研究結果一致，且除了腫瘤轉移狀態(tài)如淋巴結轉移、遠處器官轉移等，女性患者、腫瘤直徑≥3 cm等也均是影響血液EGFR基因突變檢出率的重要因素。

本研究應用肺癌組織樣本檢測和血液樣本檢測的方法進一步證實了血漿中EGFR突變檢測的可行性，但基于樣本量小，有待收集更多的病例闡明血漿樣本可以和腫瘤組織樣本EGFR檢測中發(fā)揮同等效用，甚至是在將來可以代替活檢組織樣本檢測EGFR突變。此外，血漿EGFR動態(tài)監(jiān)測可以幫助臨床醫(yī)生為患者選擇最佳治療時機，不同樣本同時進行檢測有助于提高檢出率，擴大受益人群。