吳奔紅，樊華軍，汪秋蘭，武玉婧，施春陽(yáng)

[1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030；2.英格爾檢測(cè)技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司，上海 200000；3.甘肅省白銀市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，白銀 730900]

甲硝唑?yàn)橄趸溥蝾愃幬?，?duì)革蘭陰性厭氧菌和革蘭陽(yáng)性菌均具有較好的抗菌活性，對(duì)原蟲(chóng)感染也具有較好的療效，臨床應(yīng)用非常廣泛，是世界衛(wèi)生組織(WHO) 基本藥物[1-2]。目前國(guó)內(nèi)已上市的甲硝唑制劑有片劑、膠囊劑、注射劑、栓劑和凝膠劑[3]。

2020年5月國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布《關(guān)于開(kāi)展化學(xué)藥品注射劑仿制藥質(zhì)量與療效一致性評(píng)價(jià)工作的公告》，要求對(duì)注射劑仿制藥開(kāi)展一致性評(píng)價(jià)，藥品審評(píng)中心也發(fā)布配套指導(dǎo)原則[4-6]，從多方面對(duì)注射劑仿制藥一致性評(píng)價(jià)提出技術(shù)要求，明確要求根據(jù)國(guó)際人用藥物注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)議(ICH) Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則的規(guī)定，對(duì)注射劑原料藥的元素雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)估和控制。ICH Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則將元素雜質(zhì)分為三類，注射途徑給藥要求對(duì)第1類(砷、鎘、汞、鉛)，第2(A)類(鈷、鎳、釩)和第3類中的鋰、銅、銻10種元素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)控制[7]。華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部長(zhǎng)期從事甲硝唑原料和制劑研究[8-11]，先后幫助企業(yè)獲得甲硝唑原料藥批準(zhǔn)文號(hào)和歐盟CEP證書，通過(guò)甲硝唑片一致性評(píng)價(jià)，目前正在開(kāi)展甲硝唑注射液一致性評(píng)價(jià)工作。筆者在本文參照USP<233>元素雜質(zhì)檢查法和《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)0412電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry ，ICP-MS)法指導(dǎo)原則，建立ICP-MS法測(cè)定甲硝唑原料藥(供注射用)中10種元素，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 NexION 1000型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(PE公司)；WX-8000型微波消解儀(上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司)；BSA224S型電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司，感量：0.1 mg)；UPT-II-5T型超純水儀(Ulupure公司)。

1.2試藥 標(biāo)準(zhǔn)溶液：鉛(Pb)(批號(hào)：B1906159)、鎘(Cd)(批號(hào)：B1912124)、鈷(Co)(批號(hào)：B1902041)購(gòu)于北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；汞(Hg)(批號(hào)：20A038-7)、釩(V)(批號(hào)：20A020-3)、砷(As)(批號(hào)：207003-4)、鎳(Ni)(批號(hào)：208002-8)、金(Au)(批號(hào)：19C003-1)購(gòu)于國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；鋰(Li)(批號(hào)：1094768-26)、銻(Sb)(批號(hào)：1129139-14)購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；銅(Cu)(批號(hào)：R2-CU693029)購(gòu)于Inorganic Ventures公司。內(nèi)標(biāo)：銦(117In)(批號(hào)：B1912042)購(gòu)于北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；鍺(74Ge)(批號(hào)：19B028)、鈧(45Sc)(批號(hào)：2027033)購(gòu)于國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心。各元素濃度均為1000 μg·mL-1。硝酸(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純)。自制純化水。甲硝唑原料藥(供注射用)批號(hào)為0181812001，0181912313，0181912314，由湖北省宏源藥業(yè)科技股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1元素雜質(zhì)限度的確定 參照ICH Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則，確定Pb、As、Cd、Hg、V、Ni、Co、Li、Cu、Sb 10種元素的注射每日允許暴露量(PDE)，每日藥物攝取量不超10 g的藥品，限度值(μg·g-1)=PDE(μg·d-1)/藥物日用量(g·d-1)，見(jiàn)表1。

表1 元素雜質(zhì)允許濃度值

2.2ICP-MS儀器條件 射頻功率1 600 W，霧化器流速1.00 L·min-1，碰撞氣流速4.60 mL·min-1(Pb和Hg為5.50 mL·min-1)，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為35 r·min-1，測(cè)量模式為碰撞池模式KED(Kinetic Energy Discrimination)。

2.3溶液制備

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液制備 精密量取Pb、Cd、Hg、Co、V、Ni、As、Li、Cu、Sb標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，分別用4%硝酸溶液定量稀釋制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，濃度依次為125.00，50.00，75.00，125.00，250.00，500.00，375.00，6.25×103，7.50×103，2.25×103ng·mL-1。

2.3.2內(nèi)標(biāo)溶液 分別精密量取74Ge、115In、45Sc標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2 mL，置1 L量瓶中，用4%硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得混合內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3.3供試品溶液和空白溶液 取本品0.25 g，精密稱定，置微波消解罐中，加硝酸5 mL，100 ℃條件下預(yù)消解2 h，置微波消解儀中按120 ℃3 min，150 ℃3 min，180 ℃3 min，200 ℃30 min，依次進(jìn)行消解，冷卻至室溫，120 ℃趕酸1 h，放冷。將消解罐內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用水洗滌3次，合并洗液于量瓶中(含2.00 ng·mL-1Au)，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。同法制備空白溶液。

2.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液 分別精密量取“2.3.1”項(xiàng)下Pb、Cd、Hg、Co、V、Ni、As、Li、Cu、Sb標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液各0.2，0.5，0.8，1.0，2.0 mL，分別置50 mL量瓶中(編號(hào)S1～S5)，用4%硝酸溶液(含2.00 ng·mL-1Au)稀釋至刻度，搖勻，以4%硝酸溶液(含2.00 ng·mL-1Au)為空白溶劑(編號(hào)為S0)，見(jiàn)表2。

表2 10種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液濃度

2.4測(cè)定法 內(nèi)標(biāo)溶液采用在線內(nèi)標(biāo)加入法，樣品管中依次引入標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液、空白溶液、供試品溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到各元素雜質(zhì)濃度，根據(jù)公式1計(jì)算元素雜質(zhì)含量。測(cè)定Co、V、Ni、As、Cu時(shí)，以74Ge為內(nèi)標(biāo)元素，測(cè)定Pb、Cd、Hg、Sb時(shí)，以115In為內(nèi)標(biāo)元素，測(cè)定Li時(shí)，以45Sc為內(nèi)標(biāo)元素。含量(μg·g-1)=元素濃度(ng·mL-1)×溶液體積(mL)×10-3/稱樣量(g)。

2.5方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 按照“2.3.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，加入各元素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液適量，使待測(cè)元素濃度為限度濃度，即得加標(biāo)供試品溶液。在供試品溶液測(cè)定前后，分別測(cè)定加標(biāo)供試品溶液 3次。結(jié)果Pb、Cd、Hg、Co、V、Ni、As、Li、Cu、Sb 10種元素的信號(hào)漂移值分別為1.31%，1.70%，6.45%，2.16%，0.70%，1.00%，2.76%，3.15%，3.19%，均<20%，表明此方法系統(tǒng)適用性良好。

2.5.2線性關(guān)系考察 取標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)樣分析，以待測(cè)元素與所用內(nèi)標(biāo)元素響應(yīng)值的比值(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果表明10種元素在0～200%限度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均≥0.999 8。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5.3檢測(cè)限與定量限 取“2.3.3”項(xiàng)下空白溶液進(jìn)ICP-MS分析，重復(fù)測(cè)定21次，記錄空白響應(yīng)值(cps)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(δ)。根據(jù)公式(LOD=3δ/S)計(jì)算檢測(cè)限(LOD)，公式(LOQ=10δ/S)計(jì)算定量限(LOQ)，S為各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 10種成分回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限及定量限

2.5.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照“2.5.1”項(xiàng)下方法制備6份加標(biāo)供試品溶液，進(jìn)ICP-MS分析，計(jì)算各元素含量RSD(n=6)。根據(jù)USP<233>重復(fù)性要求，RSD應(yīng)≤20%。結(jié)果Pb、Cd、Hg、Co、V、Ni、As、Li、Cu、Sb 10種元素的RSD分別為2.04%，5.32%，5.68%，3.39%，4.84%，2.41%，3.92%，4.25%，1.87%，4.03%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5中間精密度實(shí)驗(yàn) 由另一名分析人員按照“2.5.1”項(xiàng)下方法制備6份加標(biāo)供試品溶液，進(jìn)ICP-MS分析，結(jié)合重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算各元素含量RSD(n=12)。根據(jù)USP<233>中間精密度要求，RSD應(yīng)≤25%。結(jié)果Pb、Cd、Hg、Co、V、Ni、As、Li、Cu、Sb 10種元素的RSD分別為9.41%，5.77%，8.76%，3.59%，4.83%，3.71%，3.78%，4.99%，3.45%，9.19%，表明該方法中間精密度良好。

2.5.6準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 取甲硝唑原料藥(供注射用)樣品(批號(hào)：0181812001)0.25 g 9份，精密稱定，分別按限度濃度80%，100%，120%加入標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，作為低、中、高3個(gè)濃度的加標(biāo)供試品溶液，每個(gè)濃度制備3個(gè)平行樣品，進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)。10種元素的回收率在76.58%～116.48%范圍內(nèi)，符合USP<233>中回收率在70%～150%范圍內(nèi)的要求。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 10種成分回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.7耐用性實(shí)驗(yàn) 參照 “2.3.3”供試品溶液制備方法，將“2.3.3”項(xiàng)微波消解程序第4步的200 ℃下調(diào)至195 ℃，或上調(diào)至205 ℃，制備供試品溶液，再按照“2.5.1”項(xiàng)下制備加標(biāo)供試品溶液，進(jìn)行ICP-MS分析，測(cè)定各元素含量。取“2.5.1”項(xiàng)下加標(biāo)供試品溶液，將儀器泵速由35 r·min-1下調(diào)至33 r·min-1，或上調(diào)至37 r·min-1，測(cè)定各元素含量。每個(gè)條件下測(cè)定3次，計(jì)算各元素含量RSD(n=6)。改變消解溫度組中，結(jié)果Pb、Cd、Hg、Co、V、Ni、As、Li、Cu、Sb 10種元素RSD分別為1.46%，2.14%，2.55%，4.12%，5.03%，4.29%，5.27%，2.93%，1.63%，7.99%。改變泵速組中10種元素RSD分別為5.10%，5.69%，6.37%，2.87%，2.76%，2.35%，2.99%，3.63%，4.13%，5.06%，說(shuō)明該方法耐用性良好。

2.5.8樣品測(cè)定 取3批甲硝唑原料藥(供注射用)樣品，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行ICP-MS分析，儀器自動(dòng)測(cè)試3次，取3次測(cè)量平均值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各元素含量。結(jié)果批號(hào)0181812001，0181912313，0181912314樣品中Hg含量分別為0.018，0.009，0.008 μg·g-1；V含量分別為0.006，0.007，0.006 μg·g-1；Ni含量分別為0.037，0.021，0.020 μg·g-1。Pb、Cd、Co、As、Li、Cu和Sb均未檢出。3批樣品中各元素雜質(zhì)含量遠(yuǎn)低于限度值，說(shuō)明3批甲硝唑原料藥(供注射用)無(wú)元素雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)。

3 討論

雜質(zhì)控制和分析是藥品研發(fā)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。元素雜質(zhì)又稱重金屬，原義指比重大于5的金屬，元素雜質(zhì)包括可能存在于原輔料或制劑中的催化劑和環(huán)境污染物，主要在藥品生產(chǎn)或貯藏過(guò)程中生成、加入或無(wú)意引入的物質(zhì)[7]。在早期的各國(guó)藥典中，對(duì)元素雜質(zhì)的控制主要是針對(duì)重金屬和部分無(wú)機(jī)雜質(zhì)，檢測(cè)方法主要包括重金屬實(shí)驗(yàn)、熾灼殘?jiān)⒘蚧锖蜕辂}檢查以及其他的化學(xué)檢查法。

隨著藥品生產(chǎn)過(guò)程中催化劑和試劑應(yīng)用的日益廣泛，近年來(lái)元素污染的風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大，研究發(fā)現(xiàn)某些元素雜質(zhì)具有毒性，還可能對(duì)藥品的穩(wěn)定性、保質(zhì)期帶來(lái)不利影響。因此世界各國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)藥品元素雜質(zhì)的控制越來(lái)越嚴(yán)格，各國(guó)藥典經(jīng)過(guò)多次更新，目前對(duì)元素雜質(zhì)要求基本上和ICH Q3D保持一致。隨著我國(guó)2017年加入ICH，《中華人民共和國(guó)藥典》 (2020年版) 四部通則收錄的9102藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則也加入元素雜質(zhì)的控制要求，其規(guī)定與ICH幾乎一致，提高我國(guó)藥品中元素雜質(zhì)控制水平和保障患者用藥安全勢(shì)在必行。

ICH Q3D推薦ICP-MS法和ICP-OES法為元素雜質(zhì)的檢測(cè)方法。ICP-OES比較，ICP-MS檢測(cè)限更低，更適用于痕量和超痕量分析，譜線簡(jiǎn)單，可避免光譜干擾對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響[12]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇ICP-MS法。該法采用內(nèi)標(biāo)法校正基體效應(yīng)，選擇質(zhì)量數(shù)和電離能與待測(cè)元素相近的元素作為內(nèi)標(biāo)[13]，以提高分析方法的精密度。在本研究中，測(cè)定59Co、51V、60Ni、75As、63Cu時(shí)，以74Ge為內(nèi)標(biāo)元素，測(cè)定208Pb、111Cd、202Hg、121Sb時(shí)以115In為內(nèi)標(biāo)元素，測(cè)定7Li時(shí)，以45Sc為內(nèi)標(biāo)元素。

該法采用碰撞-反應(yīng)池模式(KED)校正質(zhì)譜干擾，以氦氣為碰撞氣體，利用干擾離子的碰撞截面比待測(cè)目標(biāo)離子大，碰撞幾率增加，損失更多的動(dòng)能，干擾離子無(wú)法進(jìn)入四級(jí)桿而達(dá)到消除干擾的目的[14]。KED消除干擾的能力受碰撞氣流速的影響，不同元素需設(shè)置合適的碰撞氣流速，背景等效濃度(BEC)值越低，靈敏度就越高。本研究中優(yōu)化碰撞氣流速時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流速為4.6 mL·min-1時(shí)，Pb、Hg的BEC值較高，其他元素BEC值較低；當(dāng)流速為5.5 mL·min-1時(shí)，可降低Pb、Hg的BEC值。