胡紫艷，史達(dá)，張珂，金鑫，陳鐳，張玲

(南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，南京 210000)

枸杞(Lyciumbarbarum)是國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)公布的藥食同源品種之一，既是人們?nèi)粘１＝?、滋補(bǔ)佳品，也是傳統(tǒng)中藥材，含有豐富的多糖、萜類(lèi)、黃酮和生物堿等多種活性成分和氨基酸、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[1-2]，其生物活性成分在抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]，以及改善腸道微環(huán)境[6]等多方面具有顯著的生理活性和藥用價(jià)值。枸杞等中藥材在培育、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中存在廣泛使用有機(jī)磷類(lèi)禁用農(nóng)藥和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的現(xiàn)象[7-8]，但由于使用不規(guī)范，有機(jī)磷類(lèi)禁用農(nóng)藥和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的殘留量超標(biāo)現(xiàn)象日益明顯，嚴(yán)重影響其品質(zhì)和使用安全。近年來(lái)，出口枸杞因禁用農(nóng)藥和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留超標(biāo)遭遇退運(yùn)或銷(xiāo)毀的事件時(shí)常發(fā)生，是枸杞出口面臨的主要技術(shù)性貿(mào)易壁壘[9-10]。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》未針對(duì)性的設(shè)置枸杞種植過(guò)程中常用農(nóng)藥和植物調(diào)節(jié)劑殘留量檢查項(xiàng)目。

QuEChERS前處理技術(shù)是由美國(guó)農(nóng)業(yè)部Anastassiades M教授提出的，基于固相萃取(solid-phase extraction，SPE)和基質(zhì)固相分散(matrix solid-phase dispersion，MSPD)技術(shù)改進(jìn)發(fā)展的一種前處理方式。通過(guò)選用合適的固相萃取吸附劑，隨同樣品分散到萃取液中，吸附干擾物，保留目標(biāo)物，以實(shí)現(xiàn)快速(quick)、簡(jiǎn)單(easy)廉價(jià)(cheap)、高效(effective)、穩(wěn)定(rugged)和安全(safe)的凈化基質(zhì)，以滿(mǎn)足分析檢測(cè)要求[11]。目前，QuEChERS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品、中藥材等復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)殘留量檢測(cè)的前處理過(guò)程中[12-13]。

因此，本文選用枸杞種植過(guò)程中常用的13種禁用有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥和6種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為研究對(duì)象，建立一種基于QuEChERS提取凈化和超高液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)的檢測(cè)方法，為枸杞中農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)提供一種快速、可靠的分析方法，并應(yīng)用該方法對(duì)市售50批枸杞進(jìn)行19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)殘留量的測(cè)定，以保證枸杞質(zhì)量安全。

1 儀器與試藥

1.1儀器 UPLC-MS/MS 6470液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)；XS205DU電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.1 mg)；DC24H氮吹儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；ALLEGRAX-30R高速離心機(jī)(貝克曼庫(kù)爾特有限公司)；Milli-Q超純水儀(德國(guó)默克集團(tuán))；KQ-800DE超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TM-2F渦旋振蕩器(德國(guó)WIGGENS集團(tuán))；QuEChERS萃取鹽包(無(wú)水硫酸鎂、醋酸鈉)，QuEChERS凈化包(無(wú)水硫酸鎂、PSA和C18EC，美國(guó)安捷倫公司)。

1.2藥品與試劑 乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；甲酸(色譜純，德國(guó)Fluka公司)；乙酸銨為色譜純，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

用于質(zhì)量分析的19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品信息見(jiàn)表1，以乙腈為溶劑，稀釋19種標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為10 μg·mL-1，作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-18 ℃冰箱儲(chǔ)存。50批市售枸杞樣品產(chǎn)自寧夏、青海、新疆、河北等地。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相關(guān)信息

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用Agilent HD C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為5 mmol·L-1醋酸銨溶液(含0.1%甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈，流速為0.3 mL·min-1。梯度洗脫(0～2.0 min，95% A；2.0～5.0 min，95%→25% A；5.0～9.0 min，25%→10% A)。

2.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正負(fù)離子同時(shí)掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；毛細(xì)管電壓：4000 V(+)3500 V(-)；霧化氣：氮?dú)?N2)；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：6 L·min-1；噴霧電壓：500 V；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：11 L·min-1。19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)主要質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)主要質(zhì)譜參數(shù)

2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確移取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL于同一50 mL量瓶中，用乙腈定容，配制成200 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于-18 ℃冰箱保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度為5，10，50，100，200 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.4樣品前處理

2.4.1提取 精密稱(chēng)取粉碎后枸杞(5.0 g)置50 mL離心管中，精密加1%甲酸溶液15 mL和一粒陶瓷均質(zhì)子，渦旋使藥物充分浸潤(rùn)，放置30 min，再精密加入乙腈(色譜級(jí))15 mL，渦旋5 min，加QuEChERS萃取鹽包(無(wú)水硫酸鎂6 g和無(wú)水醋酸鈉1.5 g)，立即搖散，置振蕩器上劇烈振搖3 min，于冰浴中冷卻10 min，8000 r·min-1(r=93 mm)，離心5 min。

2.4.2凈化 精密移取清液10 mL置分散固相萃取凈化管(900 mg無(wú)水硫酸鎂、150 mg PSA、150 mg C18EC)中，渦旋充分混勻，再置振蕩器上劇烈震蕩5 min，8000 r·min-1，離心5 min，精密取上清液5 mL于玻璃試管中，置氮吹儀上濃縮至0.4 mL(40 ℃)，加乙腈至約0.9 mL，渦旋混勻約15 s，再用乙腈定容到1 mL，渦旋混勻15 s。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1線性關(guān)系考察 取未檢出19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的枸杞樣品(編號(hào)：Q190805)，按“2.4”項(xiàng)下方法處理得到的提取溶液為溶劑，加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制5，10，50，100，200 ng·mL-1的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)濃度在5～200 ng·mL-1范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.995，分析結(jié)果見(jiàn)表3。19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)典型色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)典型定性、定量離子色譜圖

續(xù)圖1 19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)典型定性、定量離子色譜圖

2.5.2回收率和重復(fù)性 取未檢出19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的枸杞樣品(編號(hào)：Q190805)，粉碎后精密稱(chēng)取5.0 g，作為空白基質(zhì)樣品，分別精密加入濃度為100 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液125，250，1.25 mL，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，得到12.5，25，125 ng·mL-1，3個(gè)水平的模擬樣品考察回收率，每個(gè)濃度制備6份平行樣品，19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的回收率平均值在87.2%～115.1%，重復(fù)性RSD≤15%，見(jiàn)表3。說(shuō)明該方法對(duì)枸杞中19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的測(cè)定，具有良好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。

2.5.3穩(wěn)定性 取“2.5.1”項(xiàng)下混合對(duì)照溶液和“2.5.2”項(xiàng)下樣品加標(biāo)溶液，在室溫下分別于0，2，4，6，8 h進(jìn)樣，測(cè)定19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的峰面積，結(jié)果19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的峰面積RSD均<12%，說(shuō)明混合對(duì)照品溶液和樣品加標(biāo)溶液在室溫8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4檢出限與定量限 取“2.5.1”項(xiàng)下濃度為5 ng·mL-1混合對(duì)照溶液，采用逐級(jí)稀釋法稀釋?zhuān)孕旁氡萐/N≥3時(shí)樣品中待測(cè)物的含量為檢出限，S/N≥10時(shí)為定量限，19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的檢出限和定量限結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)線性方程、相關(guān)系數(shù)、加樣回收率、精密度、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

2.5.5基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià) 基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在進(jìn)行離子化時(shí)，因相互競(jìng)爭(zhēng)而導(dǎo)致目標(biāo)化合物信號(hào)強(qiáng)度有不同程度增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象，包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。本文采用提取后添加法，將陰性枸杞樣品按“2.4”項(xiàng)方法處理，得空白基質(zhì)溶液。分別用空白基質(zhì)溶液和純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線，按以下公式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

基質(zhì)效應(yīng)(%)=(空白基質(zhì)標(biāo)曲的斜率-溶劑標(biāo)曲的斜率)/溶劑標(biāo)曲的斜率×100%

基質(zhì)效應(yīng)在±20%以?xún)?nèi)為弱基質(zhì)效應(yīng)，在±50%以?xún)?nèi)為中等基質(zhì)效應(yīng)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)均在±30%以?xún)?nèi)，為減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，本文采用空白基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2.5.6樣品測(cè)定 采用優(yōu)化后的方法對(duì)市售不同產(chǎn)地的50批次枸杞樣品進(jìn)行19種外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)殘留量的檢測(cè)，以色譜峰的保留時(shí)間、定性離子與定量離子豐度比進(jìn)行定性分析，定量離子對(duì)進(jìn)行定量分析。其中18批檢出矮壯素、助壯素、4-硝基苯酚鈉植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留；11批檢出克百威、治螟磷2種禁用農(nóng)藥，50批樣品來(lái)源信息和檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 50批樣品來(lái)源信息和檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表4 50批樣品來(lái)源信息和檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化 采用不接分析柱的方式向質(zhì)譜系統(tǒng)注入1 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液1 μL，確定各化合物的響應(yīng)最高的2個(gè)特征離子對(duì)、碎裂電壓和碰撞能量等質(zhì)譜最佳條件。在流動(dòng)相的選擇中，分別比較了甲醇與乙腈兩種有機(jī)相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈為有機(jī)相的分離效果略?xún)?yōu)于甲醇，故采用乙腈為有機(jī)相?？疾炝怂?、0.1%甲酸溶液和5 mmol·L-1醋酸銨溶液(含0.1%甲酸)3種水相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5 mmol·L-1醋酸銨溶液(含0.1%甲酸)能夠顯著提高化合物的響應(yīng)，且在一定程度上能緩解色譜峰拖尾。

3.2提取、凈化條件選擇 枸杞基質(zhì)較為復(fù)雜，含有多糖、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、脂肪、色素[14]等多種物質(zhì)干擾測(cè)定，乙腈因具有較好的共萃性和分層性，是農(nóng)藥殘留檢測(cè)中常用的提取溶劑，本文研究參照《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則2341農(nóng)藥殘留量測(cè)定法、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》中水果蔬的農(nóng)殘?zhí)崛》椒ㄒ约拔墨I(xiàn)[15-17]方法，優(yōu)化提取、凈化條件，枸杞中水的存在會(huì)導(dǎo)致部分疏水性較強(qiáng)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑回收率極低，因此加入萃取鹽包除去樣品中水分，提高萃取效率；凈化管中PSA可凈化枸杞中有機(jī)酸、糖類(lèi)和部分色素，C18EC可以有效凈化酯類(lèi)。

在中藥高質(zhì)量發(fā)展的推動(dòng)下，科學(xué)有效地評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量是當(dāng)前質(zhì)量控制中研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，目前對(duì)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究仍然停留在對(duì)有效成分的研究，缺少安全性的評(píng)價(jià)[18-19]。枸杞作為我國(guó)中藥材走向世界的代表之一，如何利用現(xiàn)代分析技術(shù)和檢測(cè)設(shè)備多元化的分析及評(píng)價(jià)枸杞質(zhì)量是我們要解決的問(wèn)題。

枸杞在種植過(guò)程中廣泛使用農(nóng)藥和植物調(diào)節(jié)劑帶來(lái)的殘留問(wèn)題已引起國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注。有機(jī)磷類(lèi)禁用農(nóng)藥具有類(lèi)雌激素和“三致”(致癌、致畸、致誘變)作用，并易堆積于肝、腎、脾等組織中，導(dǎo)致急性或慢性中毒。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，會(huì)影響中藥材的有效性和安全性，主要體現(xiàn)為顯著影響中藥材化學(xué)成分的積累量和組成比，其在藥材中的殘留會(huì)危害服用者身體健康，盲目使用帶來(lái)的高殘留會(huì)引起肝毒性、生殖毒性、免疫毒性等[20]。

本論文通過(guò)應(yīng)用QuEChERS凈化，以液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法建立了同時(shí)檢測(cè)枸杞中19種有機(jī)磷農(nóng)藥和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等外源性風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)殘留量的方法。實(shí)驗(yàn)分別對(duì)前處理方法、色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，測(cè)定了枸杞種植過(guò)程中可能使用的有機(jī)磷類(lèi)禁用農(nóng)藥和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類(lèi)。該方法具有靈敏度高、普適性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于枸杞農(nóng)藥殘留量的測(cè)定，可為保障枸杞食用、藥用安全提供有效的技術(shù)支撐。