范秀松 劉 朋 言偉強(qiáng),*

1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科 (廣東 深圳 518035)

2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨科生物材料國家地方聯(lián)合研究中心 (廣東 深圳 518036)

1 前 言

吲哚菁綠(ICG)是一種生物相容性良好的近紅外熒光染料，可應(yīng)用于腫瘤成像診斷和光熱治療等多個領(lǐng)域[1-2]。雖然ICG已被美國藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床近紅外成像，然而其在體內(nèi)的半衰期僅有150到180秒，很容易被分解代謝，從而導(dǎo)致其在腫瘤部位蓄積時間短，限制了其廣泛的應(yīng)用。

近年來隨著納米科技的飛速發(fā)展，納米藥物遞送體系受到了廣泛的關(guān)注。納米材料可以延長血液循環(huán)時間和通過增強(qiáng)滲透和保留(EPR)效應(yīng)提高其在腫瘤部位的蓄積，實現(xiàn)對腫瘤的被動靶向[3-5]。一系列的納米顆粒(聚合物、四氧化三鐵[6]、介孔硅顆粒[7]、石墨烯[8]等)已被開發(fā)用于藥物的有效遞送、提高腫瘤部位的蓄積，其中聚合物納米顆粒由于其制備簡單、易修飾、生物相容性好等優(yōu)勢而被廣泛用于藥物的遞送[9]。因此，通過構(gòu)建ICG遞送納米顆粒可克服其半衰期短、腫瘤部位蓄積少的缺點，促進(jìn)ICG的廣泛應(yīng)用。

通過靜電作用構(gòu)建藥物遞送納米顆粒是一種綠色安全的方法，制備過程完全在水相中進(jìn)行，無需有機(jī)溶劑的參與，具有廣闊的應(yīng)用前景[10-11]。由于ICG分子帶有兩個磺酸基分子，因此其成負(fù)電性?；诖?，我們通過制備了一種帶陽離子的兩嵌段聚合物利用靜電相互作用構(gòu)建了一種聚合物遞送ICG納米顆粒，用于實現(xiàn)ICG的有效遞送和腫瘤熒光成像?？疾炝薎CG納米顆粒的尺寸、生物相容性以及在腫瘤部位的蓄積和成像效果。

2 資料和方法

2.1 基本資料

聚甲基丙烯酸聚乙二醇單甲醚 (PPEGMA,Mn=500)，4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸(CDTPA)，偶氮二異丁腈(AIBN)，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA) 和二氧六環(huán)購買自于Sigma-Aldrich。2-(2'，3'，5'-三碘苯甲?；?甲基丙烯酸乙酯(TIBMA)按照文獻(xiàn)的方法合成[12]。

2.2 PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)的合成

將 PEGMA(2.41 g) 溶解在二氧六環(huán) (5mL) 中，然后將 AIBN (7.9mg) 和CDTPA(97.2mg) 加到該溶液中。 將該混合物鼓氬氣30 分鐘除氧，并在70℃下攪拌聚合24小時。 將反應(yīng)液倒入過量的冰乙醚中，通過離心收集沉淀物并真空干燥獲得PPEGMA大分子轉(zhuǎn)移劑。

將PPEGMA-CDTPA (0.5g)、DMAEMA (0.55g) 、TIBMA(0.92g)和 AIBN (3.28mg) 溶解在二氧六環(huán) (4mL) 中。將該混合液鼓氬氣30分鐘除氧，并在70℃下攪拌聚合24小時。 將反應(yīng)液倒入大量過量的乙醚中，通過離心收集沉淀物并真空干燥獲得PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)。

2.3 ICG負(fù)載 納米顆粒的制備及表征

將5mg PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)溶于水中，然后在攪拌狀態(tài)下將1mg吲哚菁綠(ICG水溶液)滴入，室溫攪拌1h，放入3500透析袋中透析1天，收集放在4度冰箱儲藏待用。納米顆粒的粒徑及粒徑分布用動態(tài)光散射來測定。

2.4 ICG納米顆粒的生物相容性測試

通過MTT法測定ICG納米顆粒對U87(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞)的細(xì)胞毒性。，將U87細(xì)胞以5×103個細(xì)胞/孔接種于96孔板中，使用100μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。將每孔中的培養(yǎng)基更換為相同體積的含有不同濃度的 ICG納米顆粒DMEM培養(yǎng)基，并且孵育24小時。之后，將每孔中的培養(yǎng)基更換為100μL含有濃度為0.5mg/mL的MTT的DMEM培養(yǎng)基，并將細(xì)胞在37℃下再培養(yǎng)4小時。4小時后，將含 MTT 的培養(yǎng)基替換為100μL DMSO，在酶標(biāo)儀上記錄每個孔在 595nm 處的吸光度。數(shù)據(jù)表示為()。 (n=3)。

2.5 ICG納米顆粒與U87細(xì)胞的相互作用

將U87細(xì)胞接種在 4 孔Lab-Tek分室蓋玻片中(每孔5×105個細(xì)胞)，使用0.5mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基孵育過夜。然后去除培養(yǎng)基，加入含有ICG或ICG納米顆粒的培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)4h，去除培養(yǎng)基，用 PBS洗滌細(xì)胞三次并用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15分鐘。采用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，并使用共聚焦顯微鏡觀察。

2.6 ICG納米顆粒在荷瘤裸鼠中的分布

通過將U87細(xì)胞(1×106個細(xì)胞)注射到裸鼠的右側(cè)，獲得荷瘤小鼠。 待腫瘤體積增長到大約 60mm3后，將小鼠隨機(jī)分為2組，每組6只。ICG或ICG納米顆粒通過尾靜脈注射 到小鼠體內(nèi)。 在不同時間點通過小動物熒光活體成像觀察 其在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布。

3 討 論

3.1 PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)的合成

PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合的方法制備，其合成路線圖如圖1所示。首先以CDTPA為鏈轉(zhuǎn)移劑將PEGMA通過RAFT聚合制備了大分子鏈轉(zhuǎn)移劑PPEGMA，然后以PPEGMA為大分子鏈轉(zhuǎn)移劑將DMAEMA和TIBMA共聚得到兩嵌段聚合物PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)。

圖1 PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)的合成示意圖。圖2 PPEGMA 和PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)在氘代氯仿中的1H-NMR圖。圖3 PPEGMA 和PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)的GPC圖，流動相為THF。圖4 ICG納米顆粒的粒徑分布圖。圖5 ICG納米顆粒的生物相容性。圖6 ICG納米顆粒的內(nèi)吞圖。圖7 ICG納米顆粒在荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布

通過凝膠滲透色譜(GPC)和1H-NMR 證明了PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)的成功合成。在圖2中可以明顯的可以看到各氫的化學(xué)位移峰。通過積分計算得PPEGMA-b-P(DMAEMAco-TIBMA)中PPEGMA、DMAEMA和TIBMA的聚合度分別為10、41和16。利用 1H-NMR 和GPC計算所得PPEGMA 和PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)的分子量如表1所示。

表1 各聚合物的分子量(g/mol)

3.2 ICG納米顆粒的制備及表征

PPEGMA-b-P(DMAEMA-co-TIBMA)在水溶液中由于DMAEMA而帶正電，ICG則因帶有磺酸基而帶負(fù)電，因此，在水溶液中通過將 PPEGMA-b-P(DMAEMAco-TIBMA) 和 ICG混合，則可以通過靜電相互作用獲得 ICG納米顆粒，其中PPEMGA位于納米顆粒的表面，降低其在血液循環(huán)中的蛋白吸附，延長血液循環(huán)時間；帶負(fù)電的ICG和帶正電的P(DMAEMA-co-TIBMA)段形成納米顆粒的內(nèi)核。通過動態(tài)光散射測得ICG 納米顆粒的直徑為55nm。

3.3 ICG納米顆粒的體外表征

良好的生物相容性是納米顆粒用于體內(nèi)成像的首要條件，因此，我們利用MTT 法測定ICG納米顆粒對 U87細(xì)胞的毒性，結(jié)果表明，ICG納米顆粒具有良好的生物相容性，在測試濃度范圍內(nèi)不會影響U87細(xì)胞的存活率。

此外，本研究還考察了ICG納米顆粒與U87細(xì)胞的相互作用。通過將ICG納米顆粒和U87細(xì)胞共孵育3 h，然后利用共聚焦顯微鏡觀察了ICG在細(xì)胞內(nèi)的分布，實驗結(jié)果表明，ICG納米顆?？梢愿玫倪f送ICG到U87細(xì)胞里面，并且其主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。

3.4 ICG納米顆粒的體內(nèi)腫瘤成像

本研究通過小動物熒光成像考察了ICG納米顆粒在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布及在腫瘤部位的蓄積。結(jié)果表明，經(jīng)過尾靜脈注射24 h后，ICG納米顆粒可以遞送ICG到腫瘤部位，實現(xiàn)腫瘤的熒光成像，而單獨的ICG則已經(jīng)快速從體內(nèi)代謝。

4 結(jié) 論

本研究利用簡單的靜電相互作用構(gòu)建了一種聚合物ICG納米顆粒，該納米顆粒的水和粒徑為55 nm。該納米顆粒具有良好的生物相容性，并且可快速進(jìn)入U87細(xì)胞內(nèi)部，分散在細(xì)胞質(zhì)中。此外，ICG納米顆?？梢栽诨铙w腫瘤部位有效的蓄積實現(xiàn)腫瘤的熒光成像。