張滿堂 吳小永 杜敏

肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因，其中約85%為非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)，雖然臨床治療已取得了較大進展，但5年生存率仍不到20%[1-2]。因此，分析參與NSCLC進展的基因，以便更好地了解其生物學(xué)功能和作用機制，對改善患者預(yù)后具有一定幫助。TP酶激活蛋白SH3功能結(jié)合蛋白2(GTPase activating protein SH3 binding protein 2,G3BP2)位于4號染色體長臂，參與應(yīng)激顆粒的形成、細胞分化、增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[3-4]。許多證據(jù)表明，G3BP2的異常表達有助于癌癥的進展[5-9]。然而G3BP2在肺癌中的作用還不明確，本研究納入鱗狀細胞癌和腺癌患者，檢測G3BP2在不同NSCLC組織中的表達情況，并分析G3BP2與患者臨床病理特征的影響，敲低G3BP2水平分析其在NSCLC不同組織類型中可能的生物學(xué)作用。

資料與方法

一、研究對象

選取焦作市人民醫(yī)院2020年1月至2021年7月接受手術(shù)治療的NSCLC患者120例，男性占60.8%(73/120)，女性占39.2%(47/120)，年齡(58.61±6.21)歲。腺癌47例，鱗狀細胞癌73例，收集患者的腫瘤組織放置-80℃冰箱中保存。納入標準：①術(shù)后病理確診為NSCLC；②術(shù)前未接受放療、化療等新輔助治療；③病歷資料完整；④患者年齡>18歲。排除標準：①有惡性腫瘤史或有其他部位原發(fā)性腫瘤；②孕婦或哺乳期婦女；③有嚴重肝腎功能障礙或感染性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(批準編號：20191008210)，患者知情同意。

二、材料和試劑

NSCLC鱗狀細胞癌細胞NCI-H226、腺癌細胞SPC-A-1和正常支氣管上皮細胞16HBE購于中國科學(xué)院上海細胞庫。G3BP2抗兔單克隆抗體(貨號：ab230520,美國abcam公司)、β-actin抗鼠單克隆抗體(貨號：ab8826,美國abcam公司)。MTT粉末、DMSO溶液購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司、Transwell試劑盒(美國Corning公司)，蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒和細胞凋亡試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)。實時熒光定量PCR試劑盒(中國寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)。si-NC和si-G3BP2質(zhì)粒(中國豐暉生物技術(shù)有限公司)，lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(中國上海匯長生物科技有限公司)。

三、免疫組織化學(xué)方法

將組織置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)石蠟包埋后制備成厚度約4 μm的切片，經(jīng)脫蠟、水化、滲透和封閉后，滴加抗G3BP2(1∶200)，置于4 ℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗，滴加二抗(1∶400)，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3遍。滴加顯色液，置于顯微鏡下觀察。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：根據(jù)顏色深度進行評分，無顏色變化為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、褐色為3分。根據(jù)陽性細胞比例進行評分，陽性染色細胞占比≤10%為1分，陽性染色細胞占比11%～50%為2分，陽性染色細胞占比51%～75%為3分，陽性染色細胞占比>75%為4分，細胞占比評分與染色深度評分相乘總分<3分為陰性、≥3分為陽性。

四、蛋白免疫印跡法(Western blotting)實驗

利用蛋白提取試劑盒提取NCI-H226、SPC-A-1和16HBE細胞中的總蛋白，BCA檢測蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5% BSA室溫封閉2 h、抗G3BP2(1:1000稀釋，4 ℃孵育過夜)、TBST洗滌3次、二抗孵育(1:4000稀釋，室溫孵育1 h)、TBST洗滌3次后，在膜上滴加適量化學(xué)發(fā)光顯色液并置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

五、qRT-PCR實驗

Trizol試劑提取細胞中總RNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測其濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：37℃ 15min設(shè)置3個循環(huán)，85℃ 5s。以cDNA為模板，實時熒光定量PCR試劑盒說明進行PCR擴增。以管家基因U6 mRNA水平作為內(nèi)參照。引物序列：G3BP2上游引物5′-CCAGGAUCAAACGCAUGAGU-3′，下游引物5′-GAUCGUCCGCACUGGAUG CA-3′；U6上游引物5′-CGCAACAUCCUAGUCACGGACGAAG-3′，下游引物5′-UGAUAGCAGGA UACCAGCGAGGAC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算G3BP2 mRNA的相對表達水平。

六、轉(zhuǎn)染實驗

取對數(shù)生長期NCI-H226和SPC-A-1細胞以5×103個/孔的密度接種于6孔板中，分為si-NC組(轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒)、si-G3BP2組(轉(zhuǎn)染G3BP2敲低質(zhì)粒)，每組設(shè)置3個平行孔。按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說明書步驟操作，轉(zhuǎn)染6h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集各組細胞，蛋白免疫印記實驗檢測轉(zhuǎn)染效果。

七、MTT實驗

si-NC組、si-G3BP2組細胞(轉(zhuǎn)染后的細胞)以每孔4 000的密度接種于96孔板中，接種后分別在0、24、48、72h進行檢測。至檢測時間點時在檢測孔中滴加20 μL MTT溶液，孵育4h。去除上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，震蕩5min使細胞充分裂解，然后用酶標儀檢測570 nm處細胞的光密度(Optical density，OD)值。

八、Transwell實驗

si-NC組、si-G3BP2組細胞(轉(zhuǎn)染后的細胞)以每孔5×104的密度接種于小室中，在小室下部加入500 μL含有20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，放置恒溫箱中孵育48h，取出小室，放置4%多聚甲醛中固定10 min，PBS溶液清洗一遍，然后放置結(jié)晶紫溶液中染色15 min，用棉簽輕輕擦掉小室上部未穿膜的細胞，放置顯微鏡下拍照。

九、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率

利用Annexin V-FITC 和PI雙染法結(jié)合流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。si-NC和si-G3BP2細胞(轉(zhuǎn)染后的細胞)以40萬的密度接種于6孔板中，孵育48h后收集細胞，分別加入390 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，輕輕混勻，室溫避光，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況。

十、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、腺癌和鱗狀細胞癌組織中G3BP2陽性表達率比較

G3BP2在腺癌組織中的陽性表達率為68.09%，與鱗狀細胞癌組織71.23%相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=0.135，P=0.713)(見圖1)。

圖1 G3BP2在NSCLC腺癌和鱗狀細胞癌組織中的蛋白表達

a：鱗狀細胞癌組織，G3BP2陰性表達；b：鱗狀細胞癌組織，G3BP2陽性表達；c：腺癌組織，G3BP2陰性表達；d：腺癌組織，G3BP2陽性表達 (SP×200)

二、G3BP2表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

G3BP2在腺癌和鱗狀細胞癌中陽性表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(見表1)。

表1 G3BP2表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

三、NCI-H226、SPC-A-1和16HBE細胞中G3BP2蛋白及mRNA的表達情況

NCI-H226、SPC-A-1和16HBE細胞中G3BP2蛋白灰度值分別為0.91±0.11、0.96±0.06和0.12±0.05，三組間G3BP2蛋白灰度值比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=6.302，P<0.001)，且NCI-H226、SPC-A-1細胞中G3BP2蛋白灰度值高于16HBE細胞(t=8.251、9.021，均P<0.001)(見圖2)。NCI-H226、SPC-A-1和16HBE細胞中G3BP2 mRNA相對表達水平分別為1.52±0.32、1.84±0.41和1.00±0.15，三組間G3BP2 mRNA相對表達水平比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=4.362，P=0.010)，且NCI-H226、SPC-A-1細胞中G3BP2 mRNA相對表達水平高于16HBE細胞(t=4.215、4.654，均P<0.001)。

圖2 NCI-H226、SPC-A-1和16HBE細胞中G3BP2蛋白表達情況

四、敲低NCI-H226和SPC-A-1細胞中G3BP2的表達

利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將si-NC和si-G3BP2轉(zhuǎn)染至NCI-H226和SPC-A-1細胞中，NCI-H226細胞中si-G3BP2組G3BP2蛋白和mRNA相對表達水平分別為0.18±0.03、0.42±0.06，分別低于si-NC組0.94±0.05、0.95±0.10(t=9.421、6.054，P<0.001)。SPC-A-1細胞中si-G3BP2組G3BP2蛋白和mRNA相對表達灰度值為0.12±0.02、0.35±0.04，低于si-NC組0.96±0.07、0.98±0.05(t=11.062、9.329，P<0.001)(見圖3)。

圖3 敲低NCI-H226和SPC-A-1細胞中G3BP2的表達

五、敲低G3BP2后對NCI-H226和SPC-A-1細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

NCI-H226細胞和SPC-A-1細胞si-G3BP2組細胞72h時OD值分別為0.58±0.08、0.51±0.07，低于si-NC組1.23±0.12、1.35±0.10，t=11.302、13.854，均P<0.001。NCI-H226細胞和SPC-A-1細胞si-G3BP2組穿膜細胞數(shù)分別為102.4±8.6、114.7±9.4，低于si-NC組186.4±10.3、196.4±11.7，t=15.941、16.821，均P<0.001。NCI-H226細胞和SPC-A-1細胞si-G3BP2組細胞凋亡率分別為(25.8±3.6)%、(29.2±4.7)%，高于si-NC組(4.4±0.7)%、(3.9±0.5)%，t=29.326、31.054，均P<0.001(見圖4)。

圖4 敲低G3BP2后對NCI-H226和SPC-A-1細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

討 論

G3BPs包括G3BP1和G3BP2，是RNA結(jié)合蛋白家族的成員，為應(yīng)激顆粒組裝的重要組成部分，通過控制細胞的增殖、蛋白質(zhì)降解和RNA穩(wěn)定性,調(diào)節(jié)基因表達以響應(yīng)各種環(huán)境刺激[5,10]。G3BP2在食管鱗狀細胞癌中表達上調(diào)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤侵襲深度和不良預(yù)后有關(guān)[11]。為了明確G3BP2在NSCLC中的表達水平是否跟腫瘤類型相關(guān)，本研究首先檢測了腺癌組織和鱗狀細胞癌組織中G3BP2蛋白的表達，結(jié)果顯示在兩種組織中G3BP2的陽性表達率并無統(tǒng)計學(xué)差異，臨床病理資料結(jié)果顯示G3BP2陽性患者TNM分期較高且發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例較高，推測G3BP2在NSCLC中的陽性表達可促進腫瘤的進展。

在本研究中G3BP2陽性表達患者TNM晚期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者較多，提示G3BP2可能與促進NSCLC患者轉(zhuǎn)移。有研究顯示降低G3BP2的表達，可通過阻滯下游SRC/FAK信號通路傳導(dǎo)，從而抑制膀胱癌的腫瘤生長和淋巴轉(zhuǎn)移，提示G3BP2可能成為腫瘤治療的靶點[9]。為了進一步確定G3BP2在NSCLC中可能發(fā)揮的作用機制，本研究選擇鱗狀細胞癌細胞NCI-H226和腺癌細胞SPC-A-1及正常支氣管上皮細胞16HBE作為研究對象，結(jié)果顯示NCI-H226和SPC-A-1細胞中G3BP2蛋白的陽性表達高于16HBE細胞，推測G3BP2在NSCLC中的陽性表達可能與鱗狀細胞癌和腺癌的組織分型無關(guān)。敲低NCI-H226和SPC-A-1細胞中G3BP2后，可明顯抑制細胞的增殖和侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡。說明G3BP2的陽性表達促進腫瘤的進展，與G3BP2陽性表達患者TNM分期高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例高這一觀點相一致，證實了G3BP2陽性表達增強了NSCLC細胞的侵襲能力。

G3BP2促進NSCLC進展的作用機制仍需繼續(xù)探討，有研究[5]顯示在乳腺癌中，G3BP2可識別鱗狀細胞癌抗原，促進腫瘤侵襲，誘導(dǎo)乳腺腫瘤的發(fā)生。G3BP2可通過調(diào)節(jié)TWIST1信號傳導(dǎo)促進乳腺癌的進展和轉(zhuǎn)移，是驅(qū)動乳腺癌進展和不良臨床結(jié)果的關(guān)鍵因素[12]。在食管鱗狀細胞癌中，BAALC-AS1/G3BP2/c-Myc信號通路的反饋回路促進的腫瘤細胞增殖[13]。而在本研究中，G3BP2對NSCLC進展的影響如何，研究結(jié)果顯示G3BP2影響NSCLC細胞的增殖、侵襲和凋亡，但具體的作用機制尚不清楚，在下一步工作中將具體分析G3BP2促進NSCLC進展的作用機制，為G3BP2在NSCLC中的靶向治療提供依據(jù)。

綜上所述，G3BP2在NSCLC中的陽性表達可促腫瘤進展，敲低G3BP2的表達可顯著抑制NSCLC細胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡，G3BP2有望成為治療NSCLC的潛在靶點。