劉樹安 王凱 葉夢杰 張敬浩 李軻 劉媛媛 經慧 武焱旻

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是繼發(fā)于呼吸道或全身炎癥反應引起的氧療難以糾正的快速進展的呼吸困難及難治的低氧血癥，是臨床上常見的危重癥疾病之一。其病理改變主要表現(xiàn)為：肺泡上皮及肺血管內皮損傷合并毛細血管通透性增大，膠原蛋白大量積聚、炎癥介質過度釋放所致肺水腫及肺纖維化的形成。ARDS病死率較高，也是目前波及全球的新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)患者死亡原因之一，在一項統(tǒng)計分析中顯示COVID-19重癥患者死亡率為61.5%，在此之中有81%發(fā)生過ARDS[1]。研究指出，ARDS早期病程中就會出現(xiàn)膠原沉積、促纖維化生成因子水平增加，以及成纖維細胞遷移及增殖[2]。肺纖維化貫穿整個ARDS發(fā)展過程，其嚴重程度擬稱為地震后的海嘯，是導致ARDS病死率居高不下的重要原因之一[3]。在其發(fā)病機制的研究中，炎癥反應失控和 肺毛細血管屏障(PACB)功能障礙是重要因素[4]。炎癥反應失控加劇肺泡上皮細胞彌漫性損傷，使之原有結構破壞，通透性增加，進而導致炎性介質、細胞因子、趨化因子及促纖維化因子等各種因素攻擊受損的上皮細胞，經轉化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)及下游Smad2/3的活化引起上皮間質轉化，促進肺泡結構異常修復，導致肺纖維化[5-6]。在一項COVID-19所致ARDS治療的調查中顯示，即便是安全度過急性期的患者很大一部分也會死于隨后的進行性肺纖維化[7]。因此，糾正ARDS后肺纖維化是ARDS治療的重點之一[8]。間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種來源于多部位的成體干細胞，因其具有自我更新、自動歸巢及分化、促進組織修復、旁分泌等特點而廣泛用于再生醫(yī)學領域[9]。許多研究者請求投放到呼吸系統(tǒng)疾病的治療中，并在相關LPS、博來霉素等誘導的急性肺損傷模型及COVID-19、肺纖維化等疾病治療中取得成果[10-13]。MSCs來源外泌體(MSC-Exo)是MSCs旁分泌胞外囊泡(extracelluar vesicles，EV)中的一種，含脂質雙分子層結構，直徑大約30～100nm，其含母體細胞相關的核酸(miRNA等)、蛋白質等，可以維持母細胞的功能表型，具有與MSCs相同的療效，且性質更趨穩(wěn)定，是維持細胞間通訊方式和生物活性物質轉運的載體[14]。針對臨床疾病的治療，相比于直接應用間充質細胞，無細胞結構的外泌體可以避免自我復制，降低醫(yī)源性腫瘤的發(fā)生，并且其儲備更經濟方便，臨床應用更安全，甚至治療效益更強[15]。因此，我們對MSCs及MSC-Exo治療ARDS后纖維化的研究進展展開綜述，以便為基礎研究及未來的臨床應用提供一定的借鑒意義。

一、MSCs治療ARDS后肺纖維化潛在機制的研究進展

MSCs是目前研究最廣泛的成體干細胞，因其具有強大的分化潛能，免疫源性低且易于提取等優(yōu)勢，活躍在干細胞治療的領域中。針對MSCs治療ARDS后肺纖維化的臨床研究不斷開展，大量實驗結果證實其治療肺纖維化的有效性[16]?，F(xiàn)相關Ⅱ a期臨床試驗報道也證明其安全性[17]。目前也被認為是治療COVID-19最有潛力的細胞治療方式[13]。針對MSCs治療ARDS后肺纖維化的作用，目前大部分學者的觀點是其主要通過自動歸巢和分化及自分泌和旁分泌來發(fā)揮作用。

(一)通過自動歸巢及分化特性

自動歸巢特性是MSCs治療ARDS后肺纖維化的機制之一。有研究顯示，外源性MSCs可歸巢到受損傷的肺組織，變成肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar type Ⅱ epithelial cell，ATⅡ)，修復損傷的肺泡上皮及血管內皮細胞結構，降低通透性，減輕滲出及肺水腫[18]。MSCs干預治療可激活Wnt/β-catenin信號通路，并增加在受損肺組織的滯留時間，促進MSCs向ATⅡ充分分化，使ARDS模型鼠的肺損傷得到顯著緩解，印證MSCs治療ARDS的機制與其歸巢及分化特性相關[19]。對此Jiang等[20]將骨髓間充質干細胞(BMSCs)與ATⅡ共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn) BMSCs 主要分化為ATⅡ細胞。另有研究證明通過敲除基因LATS2，抑制Hippo信號通路，從而能提高MSCs在ARDS模型小鼠肺組織內的存留及向AT Ⅱ細胞分化調控肺內炎癥反應，減輕肺損傷及肺纖維化改變[21]。此外，MSCs還可以向損傷的肺泡上皮細胞遷移線粒體以及胞質信息促進上皮組織損傷的修復。Zhou等[22]將BMSCs與LPS誘導后的RAW264.7細胞共培養(yǎng)，運用Transwell 法證實其通過線粒體遷移抑制巨噬細胞凋亡，抑制急性肺損傷。但是，有些研究指出單純的MSCs植入后在肺內定植量并不高，認為其治療作用并非得益于其分化作用[23-24]，因此，鑒于MSCs治療ARDS后肺纖維化是否通過自動歸巢及分化機制尚有爭議，仍需進一步研究及驗證。

(二)通過旁分泌途徑機制

旁分泌多種細胞因子是MSCs發(fā)揮作用的又一機制，其旁分泌因子參與調控炎癥反應、調節(jié)免疫、血管生成、抗纖維化、抗菌和促進結構修復等特性，從而促進組織的恢復和再生[25]。1)MSCs可以通過調控炎癥因子及抗炎因子的活性和比例來調控炎癥反應，在Hayes 等[26]研究的人源MSCs干預呼吸機相關肺損傷模型鼠的實驗中顯示：人源MSCs通過提高角質細胞生長因子(KGF)的濃度，同時減少肺損傷炎性反應誘導產生的中性粒細胞趨化因子-1 和白細胞介素-6來調節(jié)炎癥反應，減輕肺損傷。另有研究顯示向LPS誘導的ARDS后纖維化模型鼠氣管中注射人脂肪MSCs(AD-MSCs)可以通過減少中性粒細胞浸潤改善肺損傷[27]。2)MSCs可調控巨噬細胞極化，進而調控肺組織修復。巨噬細胞是參與肺損傷的重要炎癥細胞，其調控組織異常修復，通過促進肺組織間質細胞增殖，細胞外基質過度沉積致肺纖維灶形成。M1型巨噬細胞參與ARDS急性期，發(fā)揮吞噬作用介導肺內炎癥反應。穩(wěn)定期時，其向M2型極化，分泌抗炎因子(IL-4、IL-10等)，抑制促炎細胞因子(IL-1β、IFN-α、NO等)產生。但與此同時，過多的M2型極化促進細胞增殖反應及膠原積聚[28-29]。研究者共培養(yǎng)MSCs和未極化的巨噬細胞后發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)后細胞表面持續(xù)高表達抗炎因子IL-10等，低表達抑炎因子INF-α等，從而證明MSCs能夠調控巨噬細胞極化，進而調控組織的修復作用。在Chu等[30]研究者的研究中，向博來霉素誘導的ARDS后肺纖維化模型鼠靜脈注射人臍帶MSCs(HUMSCs)，發(fā)現(xiàn)其可提高巨噬細胞基質金屬肽酶 9(MMP-9)的表達，促進膠原蛋白降解，并促進肺中 toll 樣受體 4(TLR-4)表達以促進肺泡再生，減輕肺部炎癥及上皮間質轉化程度。他們還將HUMSCs與受損傷肺上皮細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)提高了肺巨噬細胞中的 MMP-9 水平，從而促進組織修復。3)MSCs調控樹突細胞分化為調節(jié)性樹突細胞，通過免疫調節(jié)調控炎癥反應[31]。樹突細胞是機體內重要的抗原提呈細胞，免疫調控的橋梁。樹突細胞分為未成熟樹突細胞及成熟樹突細胞，成熟樹突細胞可通過抗原提呈激活T細胞，從而誘導免疫應答。ARDS時成熟樹突細胞明顯增加，并可通過增強輔助性T細胞I(Th1)型免疫反應，分泌促炎性細胞因子，加重肺部炎癥反應[32]。有研究證實，骨髓來源的MSCs可使成熟樹突細胞分化為低表達CD1a、CD80、CD86、CD40及高表達CD11b的調節(jié)性樹突細胞，促進調節(jié)性T細胞產生并進行免疫調節(jié)，從而減輕ARDS肺組織損傷[33]。更需關注的是，在新冠肺炎治療極度棘手期間，數(shù)例應用MSCs治療的臨床報道得出MSCs療法通過其免疫調節(jié)特性抑制過度激活的免疫系統(tǒng)，并促進感染患者肺微環(huán)境中肺泡細胞的組織修復，是理想的治療候選者[34-36]。4)MSCs可直接分泌多種生長因子，如KGF、血管內皮生長因子(VEGF)等，參與調控體液平衡及增加對肺損傷的治療效果。其中，MSCs分泌的KGF可以提高ATⅡ 鈉泵的表達，調控肺內滲透壓，緩解肺水腫[37]。有研究用慢病毒轉染法敲低了MSCs中的VEGF基因，通過尾靜脈向脂多糖誘導的急性肺損傷(ALI)大鼠注射MSCs，數(shù)據(jù)顯示，MSC 中 VEGF 基因敲低導致受傷肺中 VEGF 表達相對不足，并顯著降低 MSC 對急性肺損傷的治療作用，因此得出 MSC 的 VEGF 表達特征在 MSC 的治療作用中起積極作用[38]。5)MSCs通過旁分泌抗菌肽參與抗菌調節(jié)。有研究將臍帶間充質干細胞(HUMSCs)與耐藥亞胺培南的抗菌株共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可抑制抗菌株的生長，并證實其抑制機制是通過HUMSCs旁分泌抗菌肽LL-37等因子參與調控細菌生長并增強抗生素抗菌作用[39]。這也意味著MSCs的旁分泌調節(jié)在細菌肺炎、膿毒血癥等引起的ARDS中的治療潛力。

二、MSC-Exo的優(yōu)勢及治療ARDS后肺纖維化的機制

隨著MSCs在臨床治療的開展，MSCs治療的局限性也逐漸展現(xiàn)，相關研究已證實，BMSCs在低濃度的IFN-λ刺激下可成為抗原提呈細胞，表達MHC Ⅱ類抗原，已有證明這與其他因素(如低水平的TGF-β等)一起誘發(fā)免疫反應，從而引起某些小鼠模型中的BMSCs被排斥，這暗示了BMSCs在患者體內引發(fā)免疫反應的可能性，可能會加劇ARDS的進展[40]。其次，MSCs的冷凍保存需要二甲基亞砜等防腐劑，這一定程度上干擾了MSCs的活性。相對于此，MSC-Exo優(yōu)勢突出，其無細胞，不具備自我復制能力，無分化腫瘤細胞風險。其次，其發(fā)揮作用不產生MHCⅡ，因此不會激發(fā)機體免疫排斥，在凍存上，其不需要二甲基亞砜等防腐劑，避免活性干擾。除此之外，MSC-Exo相對于MSCs體積小，更易于通過毛細血管遷移至受損靶器官[41]，是MSCs無細胞替代的首選[42]。

最近的研究表明，MSCs對疾病的治療潛力依賴于它的細胞外囊泡，最主要的是外泌體[29, 43]。ISEV將其分為三種亞型，包括凋亡小體、微泡和外泌體，其中外泌體體積最小，直徑50～150nm，穩(wěn)定性最好[44]。機體內幾乎所有細胞都可以分泌外泌體，不過，MSCs分泌外泌體的能力最強，MSC-Exo通過內吞胞膜、質膜融合、釋放至胞外環(huán)境三階段產生，內含MSCs來源相關的蛋白質、核酸及脂質等遺傳信息，參與細胞間信號傳遞[45]。MSC-Exo可以應用于ARDS后肺纖維化的治療在LPS及博來霉素、大腸桿菌等干預的ARDS后肺纖維化模型中取得成果，但目前尚無相關臨床研究報道。對于其治療ARDS后肺纖維化的機制也在不斷的研究當中?，F(xiàn)有的研究支持MSC-Exo與MSCs具有同等功效，可通過抗炎、免疫調節(jié)、抑制上皮間質轉化等機制參與ARDS后肺纖維化的治療中，并且MSC-Exo 可通過內含的核酸等信息參與逆轉肺纖維化。

(一)通過抗炎、免疫、巨噬細胞表型調節(jié)參與上皮間質轉化，逆轉肺纖維化

1)通過調控炎癥因子水平。Li等人[46]將MSC-Exo尾靜脈注入內毒素誘導的ARDS模型小鼠體內，對比對照組，MSC-Exo可顯著降低ARDS模型鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平。Deng等人[47]將不同來源的間充質干細胞源外泌體對膿毒血癥所致ARDS模型鼠治療效果分析顯示，其均對ARDS的炎癥反應有抑制療效，并對肺組織的病理變化有明顯改善，此項研究提出脂肪來源間充質干細胞源外泌體效果更佳。另已有研究明確外泌體的抗炎、免疫調節(jié)等特性是其發(fā)揮作用的關鍵[48]。2)通過調節(jié)巨噬細胞表型，調控肺泡上皮細胞凋亡。Mansouri等[49]用BMSC-Exo干預博來霉素誘導的肺纖維化模型，證實其可通過調節(jié)巨噬細胞表型預防或逆轉模型鼠肺纖維化程度。高等研究者[50]以脂肪間充質干細胞來源的外泌體(ADSCs-Exo)作為干預手段，評估了其對 PM2.5 引起的肺損傷及肺纖維化的保護作用和機制，證明其治療減少了 PM2.5 誘導的 Ⅱ 型肺泡上皮細胞凋亡和壞死，減輕肺泡上皮損傷及肺纖維化的發(fā)生。與此同時，其逆轉ARDS后肺纖維的機制在不停地研究中。3)通過炎癥相關通路抑制上皮間質轉化。楊靜等[51]通過向博來霉素誘導的肺纖維化模型鼠注射人臍帶間充質干細胞源外泌體(hUCMSC-EXO)進行干預，得出hUCMSC-EXO可經阻斷TGF-β1/Smad2/3信號通路激活，抑制上皮間質轉化，緩解小鼠肺纖維化程度，并在細胞實驗中驗證了此項結論。4)通過免疫調節(jié)。Kaspi等[52]從誘導高分泌神經營養(yǎng)因子及免疫調節(jié)因子的間充質干細胞中分離外泌體干預LPS誘導的ARDS小鼠模型，相較于基本外泌體來說取得了更優(yōu)的效果，并指出這也可能成為新冠治療的有效手段。

(二)miRNA參與調控ARDS后上皮間質轉化

MSC-Exo中的核酸等信息是區(qū)別于MSCs胞外囊泡中的重要物質，其中miRNA是參與細胞間信號傳導的主要物質[53]。有研究將MSC-Exo與內毒素處理的MLE-12共培養(yǎng)，證實其通過釋放miRNA逆轉上皮間質轉化的過程，并重點研究了MCS-Exo對I-κκB(其觸發(fā)與NF-κB呈正相關)活性的影響，并指出MSC-Exo通過其miRNA減少I-κκB并增加其泛素化，導致抑制NF-κB和Hedgehog通路，以上兩個通路均是上皮間質轉化過程的重要通路，這也意味著對肺纖維化的逆轉作用[54]。另有研究通過miR-100y抑制劑轉染敲低MSCs 外泌體中的miR-100，將其與博來霉素誘導的肺泡上皮細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)MSC-Exo的治療效果明顯降低證實MSC-Exo 轉移的 miR-100 在急性肺損傷中的治療作用。

三、MSCs及MSC-Exo治療ARDS的臨床應用進展

MSCs及MSC-Exo在ARDS后肺纖維化的治療作用已有大量的基礎實驗驗證，臨床研究開展尚少，大部分小規(guī)模臨床研究繼于新冠病毒肺炎爆發(fā)后初步開展，在一項雙盲、1/2a 期、隨機對照試驗中，12名新冠后ARDS受試者分別于發(fā)病時和第 3 天接受(100±20)×106臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)的靜脈輸注，對比對照組無不良事件發(fā)生，并證實在第6天后接受 UC-MSC 治療的受試者的炎癥細胞因子顯著降低[55]。另一項隨機對照試驗中20 名患者接受了 1×106/kg UC-MSCs靜脈輸注，相比于對照組，患者生存率提高4.5倍，并證實其可通過免疫調節(jié)調控抗炎水平降低白介素水平抑制細胞因子風暴[56]。理論上，MSCs的直接輸注存在一定的風險，其治療劑量及給藥次數(shù)也是研究的重點，目前尚無明確的指南推薦，但在一項多中心2b 期試驗，受試者5天內接受 3 次靜脈輸注 1×106/kg UC-MSCs，證實重復給藥并未帶來不良事件發(fā)生[57]。相較于MSCs的直接輸注，理論上認為，MSC-Exo的安全性更高，在一項前瞻性研究中，24名新冠肺炎所致中重度ARDS患者接受單次MSC-Exo 15mL靜脈輸注，經過一次治療后患者的氧合明顯改善，其中17名患者的肺部炎癥反應被有效控制，并且無患者因MSC-Exo輸注致病情加重或死亡[58]。目前關于MSCs及MSC-Exo針對ARDS治療的臨床研究仍在不斷的進展中，尚無臨床試驗直接研究其對ARDS后肺纖維化的治療作用，但結合基礎實驗，其對ARDS發(fā)生后的炎癥控制及免疫調節(jié)是抑制ARDS后肺纖維化的治療途徑，以上相關臨床試驗在ARDS后肺纖維化的治療療效具備一定推導作用。

四、小結與展望

目前，ARDS的發(fā)病率及死亡率在全球仍然較高，目前治療尚以對癥支持治療為主，盡管目前各種治療手段已有明顯的改進，但ARDS的發(fā)病率及死亡率并未得到很好的控制，很多急性期患者經治療即使有好轉出院的可能，但其中的大部分患者仍然會因進行性的肺纖維化而死去[7]?，F(xiàn)研究支持肺纖維化貫穿ARDS的整個病程，并且肺纖維化是ARDS患者生存率及影響生活質量的重要因素，因此，控制ARDS后肺纖維化的治療是ARDS治療重點。

MSCs家族主要成員包括BMSCs、ADSCs和HUMSCs等干細胞成員，近年來應用該類細胞對組織纖維化及其肺部損傷等疾病的治療已經成為生物醫(yī)學研究的熱點領域。但是MSCs應用于臨床治療局限性大，因此具有MSCs同等功效且性質更加穩(wěn)定，且風險更低，儲存更方便等優(yōu)勢的外泌體逐漸成為研究熱點[41]。糾正肺纖維化是改善ARDS患者長期預后的治療重點，研究支持MSCs及MSC-Exo可以用于干預ARDS后肺纖維，但其具體機制尚不完全清楚。因此，有必要進一步研究 MSC 衍生的Exo治療ARDS后肺纖維化的潛在能力。目前MSCs及Exo在ARDS后肺纖維化的治療潛力已不斷有相應的基礎實驗數(shù)據(jù)表明，其在新冠肺炎中的臨床應用療效也有初步的臨床數(shù)據(jù)支持，但針對其用藥劑量及療程尚無明確指南推薦，并且針對其治療ARDS后肺纖維化的臨床應用尚無相關臨床研究報道，其中的作用機制仍在不停地探索中。深入研究ARDS后肺纖維化的發(fā)病機制及外泌體干預ARDS后肺纖維化的作用機制，是為ARDS后肺纖維化治療提供精準治療靶點的重點。