徐佳偉 尤雯雯

浙江省麗水市中心醫(yī)院藥學(xué)部 (浙江 麗水， 323000)

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，5年存活率為18%，是僅次于胰腺癌的第二大致命性腫瘤[1]。肝癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟的過程，由外界刺激引起肝細(xì)胞或干細(xì)胞的基因改變，導(dǎo)致增殖、凋亡抑制、發(fā)育異常和腫瘤形成[1]。目前，晚期肝癌的預(yù)后和治療效果仍然很差。尋找有效的藥物并了解其作用機(jī)制非常重要。

淫羊藿苷(ICA)是從淫羊藿屬植物中提取的一種黃烷醇糖苷，具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、骨保護(hù)、抗炎和抗腫瘤等多種藥理作用[2]。近年來，淫羊藿苷已被證明在各種類型的人類癌細(xì)胞中具有抗癌作用，包括結(jié)腸癌[3]、胃癌[4]、卵巢癌[5]和非小細(xì)胞肺癌等[6]。早期體外研究表明，淫羊藿苷抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[7]，但I(xiàn)CA對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用機(jī)制尚不明確。因此，本文旨在探討淫羊藿苷對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的影響及 其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 ICA(純度>98%)購自中國(guó)藥品生物制品檢定所，以20 mM的濃度溶解在二甲基亞砜(DMSO)中作為儲(chǔ)備溶液，儲(chǔ)存于-20℃，并在使用前用培養(yǎng)基稀釋。Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)購自Gibco，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)購自廣州益源生物科技有限公司。膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自KeyGEN生物技術(shù)公司。CH-223191(AHR拮抗劑)購自Selleckchem，用DMSO溶解?？贵wBcl-2、Bax、CyclinD1、CDK4、芳烴受體(AHR,#83200)和β-actin (#3700)購自Cell Signaling Technology。BCA 蛋白定量試劑盒、 細(xì)胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 人肝癌細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，細(xì)胞在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM中。

1.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖 用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)測(cè)定細(xì)胞活力。每孔100 μl的培養(yǎng)基在96孔板中接種的5 000個(gè)細(xì)胞，施加不同濃度的ICA(0-40 μM)或DMSO分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，每孔細(xì)胞用10 μl CCK-8溶液在37℃的5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，最后用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度。為了確定AHR在ICA處理的HepG2細(xì)胞中的作用，在有或沒有ICA(20 μM)培養(yǎng)的細(xì)胞中施用不同濃度的AHR拮抗劑CH223191(0-20 μM)，如上測(cè)定吸光度。

1.4 集落形成試驗(yàn) HepG2細(xì)胞以1×103個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，有或沒有ICA(20 μM )培養(yǎng)，當(dāng)平板上形成可見的克隆時(shí)，用PBS洗滌菌落，用甲醇(0.5 ml/孔)室溫固定20 min，然后用PBS洗滌3次，室溫下用0.5%結(jié)晶紫染色30 min。染色細(xì)胞用PBS清洗5次，在室溫下風(fēng)干2 h。在顯微鏡(奧林巴斯MTV-3)下計(jì)數(shù)含有>50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種在6孔板中過夜培養(yǎng)，施加不同濃度的ICA或DMSO孵育48 h，孵育結(jié)束后，用細(xì)胞周期染色試劑盒進(jìn)行細(xì)胞周期分析。先用70%冰冷乙醇固定細(xì)胞，在4℃孵育過夜，冷PBS洗滌，100 μl RNase處理30 min，再懸浮在400 μl碘化丙啶(PI)培養(yǎng)基中，在黑暗室溫下孵育30 min。用BD LSR Ⅱ流式細(xì)胞儀軟件分析細(xì)胞周期分布。細(xì)胞凋亡按Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。處理后的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，離心制粒，然后用PBS洗滌兩次。然后用5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI溶液在20℃黑暗中染色15 min，最后用400 μl的Annexin V結(jié)合緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，BD LSR Ⅱ流式細(xì)胞儀對(duì)各組細(xì)胞凋亡率進(jìn)行分析。

1.6 蛋白免疫印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞用裂解緩沖液在冰上裂解20 min，然后在4℃下16 000 g離心15 min。BCA試劑盒檢測(cè)上清液中的蛋白質(zhì)濃度。用SDS-PAGE(12%)分離每個(gè)泳道40 μg上清液蛋白的樣品，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，封閉1 h后，將膜與一抗(1∶1 000)在4℃孵育過夜，然后將膜與含有辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶3 000)在25℃孵育1 h。采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光儀(ECL)檢測(cè)免疫反應(yīng)條帶，并用圖像采集系統(tǒng)拍攝。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有結(jié)果都表示為至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICA抑制肝癌細(xì)胞增殖 與DMSO組相比，ICA以劑量和時(shí)間依賴的方式抑制肝癌細(xì)胞增殖(圖1A～C)。同樣，ICA(20 μM )處理的肝癌HepG2細(xì)胞的集落形成能力顯著低于DMSO組(P<0.001，圖1D～E)。

圖1 ICA對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響 A～C：CCK8測(cè)定不同濃度的ICA處理肝癌HepG2細(xì)胞24、48和72 h后的細(xì)胞增殖抑制率；D～E：ICA(20 μM)處理肝癌HepG2細(xì)胞的集落形成能力；與DMSO(ICA 0 μM)組比較，*P<0.05，***P<0.001

2.2 ICA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯 ICA增加了HepG2細(xì)胞的G0/G1細(xì)胞周期階段的細(xì)胞數(shù)量百分比(P<0.001，圖2A)，通過蛋白印跡分析評(píng)估參與細(xì)胞周期過程的蛋白表達(dá)，結(jié)果提示ICA以劑量依賴性方式降低CDK4和cyclinD1蛋白表達(dá)(P<0.001，圖2B)，這些結(jié)果證實(shí)了ICA誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯。

圖2 ICA對(duì)肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 A：流式細(xì)胞測(cè)定不同濃度的ICA處理肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期；B：通過蛋白印跡分析CDK4和cyclinD1蛋白的表達(dá)。與DMSO(ICA 0 μM)組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 ICA促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡 ICA顯著提高了HepG2細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞的百分比，并呈劑量依賴性方式誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡(P<0.05，圖3A)。同時(shí)分析細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在ICA增加了Bax和降低了Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.001，圖3B)。

圖3 ICA對(duì)肝癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響 A：流式細(xì)胞測(cè)定不同濃度的ICA處理肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞凋亡；B：通過蛋白印跡分析Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。與DMSO(ICA 0 μM)組比較， *P<0.05，***P<0.001

2.4 ICA通過激活A(yù)HR途徑發(fā)揮其抗細(xì)胞增殖作用 ICA增加HepG2細(xì)胞AHR蛋白表達(dá)的水平(P<0.01，圖4A)。接著，我們通過用AHR拮抗劑CH223191培養(yǎng)來確定ICA對(duì)HepG2細(xì)胞的作用是否減弱。用CH223191(1、10和20 μM)培養(yǎng)對(duì)體外HepG2細(xì)胞的增殖沒有顯著影響，而ICA(20 μM)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響被CH223191作用消除(P<0.05，圖4B)。用CH223191培養(yǎng)后降低ICA (20μM)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞中AHR水平(P<0.001，圖4C)。這些結(jié)果表明ICA對(duì)細(xì)胞增殖的影響至少部分依賴于體外HepG2細(xì)胞中的AHR信號(hào)傳導(dǎo)。

圖4 ICA對(duì)肝癌細(xì)胞AHR途徑的影響A：蛋白印跡分析ICA處理后AHR蛋白的表達(dá)；B：CCK8測(cè)定不同濃度CH223191處理對(duì)ICA存在的細(xì)胞增殖的影響；C：蛋白印跡分析CH223191對(duì)ICA處理后AHR蛋白表達(dá)的影響。與DMSO(ICA 0 μM)組比較，**P<0.01，***P<0.001，與ICA (20 μM)組比較， ##P<0.01，###P<0.001

3 討論

肝癌是癌癥相關(guān)死亡的常見原因，HCC占原發(fā)性肝癌的80%～90%[1]。盡管 HCC的治療策略在不斷進(jìn)步，但其總體預(yù)后仍然很差。越來越多的文獻(xiàn)研究中藥在肝癌中的抗腫瘤活性[8]。淫羊藿苷的抗腫瘤活性在體外和體內(nèi)的腫瘤中均得到了廣泛的研究和報(bào)道，但其確切的抗腫瘤機(jī)制還有待揭示[9]，我們的研究表明，ICA在體外對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞具有抗癌作用。ICA可抑制HepG2細(xì)胞的集落形成和增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，從機(jī)制上，我們通過AHR抗結(jié)劑評(píng)估了ICA可能通過激活A(yù)HR抑制細(xì)胞增殖。

據(jù)報(bào)道，ICA可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，且沒有明顯的副作用[2,3,6]。先前的研究表明，細(xì)胞周期停滯在G0/G1期可以抑制HepG2細(xì)胞的增殖[10]。朱燕輝等報(bào)道，ICA能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721阻滯于G0/G1期并抑制其凋亡[11]。在本研究中，淫羊藿苷顯著增加了G0/G1細(xì)胞的比例，并降低S期細(xì)胞比例，表明淫羊藿苷抑制肝細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。此外，CDK4和cyclinD1作為細(xì)胞周期進(jìn)程中的重要蛋白，可以誘導(dǎo)細(xì)胞從G1進(jìn)展到S期[10]。我們觀察到ICA顯著降低細(xì)胞周期蛋白CDK4和cyclinD1的表達(dá)，這支持了細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。細(xì)胞凋亡失衡是腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制之一。已經(jīng)表明淫羊藿苷在體外可能通過降低Bcl-2、升高Bax蛋白的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡[11]。本研究的結(jié)果與之前的報(bào)道一致，提示ICA能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，并激活凋亡標(biāo)記蛋白Bax和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)。

AHR在多種腫瘤中均高度表達(dá)并長(zhǎng)期激活，其激活的生理作用在致癌作用中起關(guān)鍵作用[12]。Liu等結(jié)果提示AHR表達(dá)的增加與肝細(xì)胞癌的進(jìn)展有關(guān)，并且可能在肝細(xì)胞癌的治療中發(fā)揮潛在作用[13]。之前的研究的表明，抗AHR的內(nèi)源性配體通過AHR激活顯著抑制HCC細(xì)胞HCCLM3和SMMC-7721細(xì)胞的增殖，并通過改變相關(guān)蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)G0/G1期阻滯和凋亡[14]。因此，我們研究了AHR信號(hào)在肝細(xì)胞癌增殖和凋亡影響中的作用，結(jié)果顯示ICA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響被AHR的一種特異性拮抗劑CH223191阻斷。綜上，ICA抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0～G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與AHR信號(hào)的激活有關(guān)。