劉曉暉 何 勇 符奉川 鐘小薇

1.海口市第三人民醫(yī)院外科 (海南 海口， 571100) 2.?？谑械谌嗣襻t(yī)院檢驗科

肝癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈增長趨勢[1]。紫杉醇是目前較為常用的抗肝癌藥物，但長期使用易引起肝癌耐藥性，改善肝癌紫杉醇耐藥性是當(dāng)前研究的重要課題。環(huán)狀RNA(circRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類非編碼RNA，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性行為及耐藥性[2,3]。circNOLC1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種circRNA，調(diào)控多種腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。研究顯示，circNOLC1在前列腺癌組織和細(xì)胞中過表達(dá)，其可通過靶向結(jié)合miR-647上調(diào) PAQR4表達(dá)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移，circNOLC1可能是前列腺癌治療的潛在靶點[4]。circNOLC1在上皮性卵巢癌(EOC)組織中的表達(dá)高于正常組織，且其高表達(dá)與FIGO分期和腫瘤分化程度密切相關(guān)，circNOLC1可能通過結(jié)合ESRP1并調(diào)節(jié)CDK1和RhoA表達(dá)來促進(jìn)EOC的發(fā)生和發(fā)展[5]。Starbase靶基因在線軟件預(yù)測顯示，circNOLC1可能靶向結(jié)合miR-485-5p。研究顯示，miR-485-5p在肝癌中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-485-5p可削弱肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，miR-485-5p可能為肝癌的治療提供了新靶點[6]。本研究主要觀察了circNOLC1和miR-485-5p對紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及circNOLC1能否靶向miR-485-5p發(fā)揮作用，以期為改善肝癌紫杉醇耐藥性提供分子靶點。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 HCCLM3細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自大連寶生物；RPMI 1640培養(yǎng)基、LipofectamineTM 2000試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京索萊寶；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青；PCR引物、si-circNOLC1、si-NC、miR-485-5p mimics、miR-NC、anti-miR-485-5p、anti-miR-NC及circNOLC1野生型和突變型熒光素酶載體(WT-circNOLC1、MUT-circNOLC1)購自上海生工；蛋白質(zhì)印跡實驗所需抗體購自中國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞的建立 用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HCCLM3細(xì)胞。參照文獻(xiàn)[7]采用濃度梯度間歇刺激法誘導(dǎo)HCCLM3細(xì)胞，獲得紫杉醇耐藥的細(xì)胞HCCLM3/Tax。具體方法如下：取對數(shù)期HCCLM3細(xì)胞，加含0.05 μmol/L紫杉醇和10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞，重新加含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長密度至90%時，傳代培養(yǎng)。再次用含0.05 μmol/L紫杉醇和10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，如此反復(fù)換液、傳代。然后依次用含0.1 、0.15、0.20 μmol/L紫杉醇的培養(yǎng)液干預(yù)，每個濃度重復(fù)3次，最后獲得紫杉醇耐藥的人肝癌細(xì)胞HCCLM3/Tax。HCCLM3/Tax細(xì)胞一直用含低濃度(0.02 μmol/L)紫杉醇的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.2.2 紫杉醇對HCCLM3、HCCLM3/Tax的半數(shù)抑制濃度 將HCCLM3、HCCLM3/Tax均接種至96孔板中(2.5×104個/孔)，分別用含0、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56 μmol/L[7]紫杉醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，加10 μl CCK-8。孵育2 h，酶標(biāo)儀測光密度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(OD對照組-OD實驗組)/OD對照組×100%。采用GraphPad Prism 7軟件計算紫杉醇對HCCLM3、HCCLM3/Tax的半數(shù)抑制濃度(IC50值)。

1.2.3 RT-qPCR檢測circNOLC1和miR-485-5p表達(dá) 將HCCLM3、HCCLM3/Tax均接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，用RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，行PCR擴增。引物序列：circNOLC1：上游5'-GTACGATAGGCTCGATCGTAC-3'，下游5'-CGTCTCTGAGGCTAGCC-3'；GAPDH：上游5'-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3'，下游5'-GACTCATGACCACAGTCCAT GC-3′；miR-485-5p：上游5'-CCAAGCTTCACCCATTCCTAACAGGAC-3'，下游5'-CGGGATCC GTAGGTCAGTTACATGCATC-3'；U6：上游5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'，下游5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。2-△△Ct法計算circNOLC1相對GAPDH、miR-485-5p相對U6的表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HCCLM3/Tax細(xì)胞接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，換為不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)液。用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-circNOLC1、miR-NC、miR-485-5p mimics、共轉(zhuǎn)染si-circNOLC1與anti-miR-NC、si-circNOLC1與anti-miR-485-5p。轉(zhuǎn)染12 h后，棄培養(yǎng)液，重新加含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，RT-qPCR法檢測細(xì)胞中circNOLC1或miR-485-5p表達(dá)驗證轉(zhuǎn)染效果，方法同1.2.3，并收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率 取96孔板，接種轉(zhuǎn)染si-NC、si-circNOLC1、miR-NC、miR-485-5p mimics、共轉(zhuǎn)染si-circNOLC1與anti-miR-NC、si-circNOLC1與anti-miR-485-5p后的HCCLM3/Tax細(xì)胞(2.5×104個/孔)，用含0.16 μmol/L紫杉醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，依次標(biāo)記為Tax+si-NC組、Tax+si-circNOLC1組、Tax+miR-NC組、Tax+miR-485-5p 組、Tax+si-circNOLC1+anti-miR-NC組、Tax+si-circNOLC1+anti-miR-485-5p組。加10 μl CCK-8，孵育2 h，酶標(biāo)儀測光密度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(OD對照組-OD實驗組)/OD對照組×100%。

1.2.6 克隆形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成能力 取6孔板，接種轉(zhuǎn)染后的HCCLM3/Tax細(xì)胞(1.0×105個/孔)，用含0.16 μmol/L紫杉醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)，并按照上述1.2.5標(biāo)記分組。每2天更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)10～14 d后，棄培養(yǎng)液。用4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡觀察并統(tǒng)計細(xì)胞克隆數(shù)。

1.2.7 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移 取6孔板，接種轉(zhuǎn)染后的HCCLM3/Tax細(xì)胞(1.0×105個/孔)，用常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)液。用200 μl移液器槍頭在培養(yǎng)板底部劃兩條平行線，并PBS除去劃痕間細(xì)胞，測量劃痕間距(d)，記為d0 h。然后用含0.16 μmol/L紫杉醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，并按照上述1.2.5標(biāo)記分組。棄培養(yǎng)液，再次測量細(xì)胞間間距，記為d24 h。劃痕愈合率(%)=(d0 h-d24 h)/d0 h×100%。

1.2.8 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲 取6孔板，接種轉(zhuǎn)染后的HCCLM3/Tax細(xì)胞(1.0×105個/孔)，用含0.16 μmol/L紫杉醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，并按照上述1.2.5標(biāo)記分組。培養(yǎng)后，收集各組細(xì)胞，并調(diào)整密度為1.0×105個/ml。將Transwell小室上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，自然晾干后，加100 μl各組細(xì)胞懸液，另取500 μl培養(yǎng)液加至Transwell下室。培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察，隨機取5個視野，記數(shù)。

1.2.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá) 取6孔板，接種轉(zhuǎn)染后的HCCLM3/Tax細(xì)胞(1.0×105個/孔)，用含0.16 μmol/L紫杉醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，并按照上述1.2.5標(biāo)記分組。培養(yǎng)后，用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白。經(jīng)BCA法測蛋白濃度、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，于4℃冰箱中分別用MMP-2(1∶500)、MMP-9(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)一抗孵育過夜。洗膜后，再于37℃搖床中用山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育2 h。最后加顯影液，避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析MMP-2、MMP-9相對GAPDH的表達(dá)量。

1.2.10 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?取6孔板，接種HCCLM3/Tax細(xì)胞(1.0×105個/孔)，用含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，換為不含F(xiàn)BS的RPMI 1640培養(yǎng)液。用LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體法，分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circNOLC1與miR-485-5p mimics或miR-NC、MUT-circNOLC1與miR-485-5p mimic或miR-NC。轉(zhuǎn)染12 h后，更換為含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。再培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液。加細(xì)胞裂解液，充分裂解后，離心(3 500 r/min、5 min)。取上清液，檢測熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲與海腎的熒光強度比值表示。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇對HCCLM3細(xì)胞和HCCLM3/Tax細(xì)胞抑制率的影響 紫杉醇對HCCLM3、HCCLM3/Tax細(xì)胞的抑制率隨著其濃度的增加逐漸升高。與HCCLM3細(xì)胞比較，相同濃度的紫杉醇對HCCLM3/Tax細(xì)胞的抑制率降低(P<0.05)。紫杉醇對HCCLM3、HCCLM3/Tax細(xì)胞的IC50值分別為(0.40±0.06)μmol/L、(2.71±0.37)μmol/L。見表1。

表1 紫杉醇對HCCLM3細(xì)胞和HCCLM3/Tax細(xì)胞抑制率的影響

2.2 circNOLC1和miR-485-5p在HCCLM3和HCCLM3/Tax細(xì)胞中的表達(dá) 與HCCLM3細(xì)胞比較，HCCLM3/Tax細(xì)胞中circNOLC1的表達(dá)升高(P<0.05)，而miR-485-5p的表達(dá)降低(P<0.05)。見表2。

表2 circNOLC1和miR-485-5p在HCCLM3細(xì)胞和HCCLM3/Tax細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 敲減circNOLC1聯(lián)合紫杉醇對HCCLM3/Tax細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與轉(zhuǎn)染si-NC的HCCLM3/Tax細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染si-circNOLC1的HCCLM3/Tax細(xì)胞中circNOLC1的表達(dá)量顯著降低(0.18±0.03比1.00±0.00，t=82.000，P<0.05)。與Tax+si-NC組比較，Tax+si-circNOLC1組HCCLM3/Tax細(xì)胞抑制率升高(P<0.05)，克隆形成數(shù)、劃痕愈合率和侵襲數(shù)均降低(P<0.05)，遷移和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)降低(P<0.05)。見圖1、表3。

表3 敲減circNOLC1聯(lián)合紫杉醇對HCCLM3/Tax細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖1 敲減circNOLC1聯(lián)合紫杉醇對HCCLM3/Tax細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

2.4 過表達(dá)miR-485-5p聯(lián)合紫杉醇對HCCLM3/Tax細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與轉(zhuǎn)染miR-NC的HCCLM3/Tax細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染miR-485-5p mimics的HCCLM3/Tax細(xì)胞中miR-485-5p的表達(dá)量顯著升高(2.99±0.23比1.00±0.00，t=25.957，P<0.05)。與Tax+miR-NC組比較，Tax+miR-485-5p組HCCLM3/Tax細(xì)胞抑制率升高(P<0.05)，克隆形成數(shù)、劃痕愈合率和侵襲數(shù)均降低(P<0.05)，遷移和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9表達(dá)降低(P<0.05)。見圖2，表4。

表4 過表達(dá)miR-485-5p聯(lián)合紫杉醇對HCCLM3/Tax細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖2 過表達(dá)miR-485-5p聯(lián)合紫杉醇對HCCLM3/Tax細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

2.5 circNOLC1靶向調(diào)控miR-485-5p的表達(dá) StarBase靶基因在線軟件預(yù)測顯示的circNOLC1與miR-485-5p的結(jié)合位點見圖3。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circNOLC1與miR-485-5p mimics的HCCLM3/Tax細(xì)胞熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circNOLC1與miR-NC的細(xì)胞(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染MUT-circNOLC1與miR-485-5p mimics的HCCLM3/Tax細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染MUT-circNOLC1與miR-NC的細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5。與轉(zhuǎn)染si-NC的HCCLM3/Tax細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染si-circNOLC1的HCCLM3/Tax細(xì)胞中miR-485-5p的表達(dá)量顯著升高(3.11±0.26比1.00±0.00，t=24.346，P<0.05)。

圖3 circNOLC1的序列中含有與miR-485-5p互補的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6 干擾miR-485-5p逆轉(zhuǎn)敲減circNOLC1聯(lián)合紫杉醇對HCCLM3/Tax細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 與共轉(zhuǎn)染si-circNOLC1與anti-miR-NC的HCCLM3/Tax細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染si-circNOLC1與anti-miR-485-5p的HCCLM3/Tax細(xì)胞中miR-485-5p的表達(dá)量顯著降低(0.35±0.04比1.00±0.00，t=48.750，P<0.05)。與Tax+si-circNOLC1+anti-miR-NC組比較，Tax+si-circNOLC1+anti-miR-485-5p組HCCLM3/Tax細(xì)胞抑制率降低(P<0.05)，克隆形成數(shù)、劃痕愈合率和侵襲數(shù)均升高(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見圖4，表6。

表6 干擾miR-485-5p逆轉(zhuǎn)敲減circNOLC1聯(lián)合紫杉醇對HCCLM3/Tax細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

圖4 干擾miR-485-5p逆轉(zhuǎn)敲減circNOLC1聯(lián)合紫杉醇對HCCLM3/Tax細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的作用

3 討論

circRNA是一種呈閉合環(huán)狀的非編碼RNA，其可發(fā)揮miRNA分子海綿作用影響miRNA靶基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用。近年來研究表明，circRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞對化療藥物紫杉醇的敏感性。circRNF111在紫杉醇抗性的乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)增加，敲低circRNF111可在體外抑制紫杉醇抗性的乳腺癌細(xì)胞生長、侵襲和糖酵解，其作用機制與靶向調(diào)控miR-140-5p/E2F3軸有關(guān)[8]；circ_0002874的下調(diào)可通過調(diào)節(jié)miR1273f/MDM2/P53信號通路逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性[9]；circ_CELSR1在紫杉醇耐藥的卵巢癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其通過調(diào)節(jié)miR-149-5p/SIK2軸增強卵巢癌細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性[10]；circBIRC6在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，敲減circBIRC6可通過靶向上調(diào)miR-877-5p降低肝癌細(xì)胞對紫杉醇抗性軸[11]。這些參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞對紫杉醇耐藥性的circRNA為改善腫瘤對紫杉醇的耐藥性提供了潛在分子靶點。

作為一種circRNA，目前對circNOLC1影響腫瘤發(fā)展的研究還很少見。本研究顯示，circNOLC1在紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，敲減circNOLC1可阻礙紫杉醇處理的紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示circNOLC1可作為逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞對紫杉醇耐藥性的分子靶點。細(xì)胞遷移和侵襲受多種基因分子和信號通路的調(diào)控，其中MMP-2和MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，表達(dá)增加使促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[12]。本研究顯示，敲減circNOLC1可降低紫杉醇處理的紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，提示敲減circNOLC1可能通過調(diào)控MMP-2和MMP-9表達(dá)來抑制紫杉醇處理的紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞遷移和侵襲。

為了進(jìn)一步探究敲減circNOLC1降低紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性的分子機制，本研究證實了circNOLC1可靶向結(jié)合miR-485-5p，且敲減circNOLC1能夠促進(jìn)紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞中miR-485-5p的表達(dá)，說明circNOLC1靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-485-5p。miR-485-5p參與調(diào)控多種腫瘤的惡性表型，與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示，miR-485-5p在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺腺癌、腎細(xì)胞癌、肝癌和乳腺癌等腫瘤中表達(dá)降低，上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的惡性行為，進(jìn)而阻礙腫瘤發(fā)展進(jìn)程[13-17]。此外，miR-485-5p還影響腫瘤的放化療療效。研究顯示，miR-485-5p在順鉑耐藥的皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可通過靶向抑制REV3L阻礙順鉑耐藥的皮膚鱗狀細(xì)胞癌增殖、遷移和侵襲，并降低細(xì)胞對順鉑的耐藥性[18]；miR-485-5p表達(dá)的上調(diào)可通過靶向抑制FERMT1增強食管癌細(xì)胞的放射敏感性，miR-485-5p可作為改善食管癌放射抵抗的分子靶點[19]。本研究結(jié)果顯示，miR-485-5p在紫杉醇耐藥的肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低，過表達(dá)miR-485-5p可降低紫杉醇處理的紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，這說明過表達(dá)miR-485-5p增強了紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性，提示miR-485-5p可作為改善肝癌細(xì)胞紫杉醇耐藥性的分子靶點。同時，本研究還顯示，干擾miR-485-5p降低了敲減circNOLC1對紫杉醇處理的紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用，進(jìn)一步提示敲減circNOLC1通過靶向上調(diào)miR-485-5p來降低紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性。

綜上所述，circNOLC1在紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而miR-485-5p表達(dá)下調(diào)；敲減circNOLC1可削弱紫杉醇處理的紫杉醇耐藥肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機制可能與靶向上調(diào)細(xì)胞中miR-485-5p的表達(dá)有關(guān)，circNOLC1/miR-485-5p軸可能為改善肝癌紫杉醇耐藥性提供了分子靶點，但尚需在體內(nèi)進(jìn)行驗證。