李昆諭，劉玉芳，陶 林，江炎庭，歐陽依娜，儲明星*，

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南昆明 650224；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056001；3.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193)

產(chǎn)羔性狀對于山羊的生產(chǎn)尤其重要，而提高單胎產(chǎn)羔數(shù)是提高產(chǎn)羔性狀最主要的途徑。山羊產(chǎn)羔數(shù)是一個極其復雜的性狀，且產(chǎn)羔性狀遺傳力較低(約為0.1)，因此如何快速提高山羊產(chǎn)羔數(shù)是養(yǎng)羊業(yè)一個亟待解決的難題。與傳統(tǒng)育種手段相比，分子遺傳育種具有準確度高、可操作性強、育種成本低等優(yōu)點，能更加高效、快速地對山羊產(chǎn)羔性狀進行改良。利用分子標記技術(shù)有利于高繁殖力山羊的篩選，從而加快育種進程，可為山羊的選育工作提供更多便利[1]。ESR1(estrogen receptor 1)基因定位于9號染色體，擁有12個外顯子。雌激素受體α由ESR1編碼，通過與靶基因上的特異性效應(yīng)元件結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達[2]。雌激素受體α為雌激素的受體，與雌激素結(jié)合后，對胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中卵泡的生長發(fā)育都發(fā)揮著重要作用[3]。研究表明，ESR基因是調(diào)控豬高產(chǎn)仔數(shù)的主效基因之一[4]。Tao等[5]通過GWAS、ROH 分析和選擇特征檢測發(fā)現(xiàn)ESR1是參與山羊卵巢功能的一個重要候選基因。TENM1和THEM4基因分別定位于山羊X號和3號染色體，分別擁有35個和6個外顯子。Lai等[6]通過對奶山羊進行全基因組測序發(fā)現(xiàn)THEM4 在高繁殖力組中被特異性選擇，TENM1 在低繁殖力組中被特異性選擇。TENM1 屬于Tenm/Odz基因家族。研究表明，Ten-M參與胚胎早期發(fā)育的調(diào)節(jié)，并在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育后期發(fā)揮作用[7-8]。

該研究所用候選基因來自實驗室前期重測序數(shù)據(jù)，通過GWAS分析(顯著性閾值為0.05)所得的在云上黑山羊(云上黑山羊是以云嶺山羊為母本、努比山羊為父本培育而成的我國第一個肉用黑山羊品種[9-10])全基因組中的正選擇基因(positively selected genes,PSG)。結(jié)合文獻資料推測ESR1、TENM1和THEM4 可能對山羊繁殖性狀有一定的影響，在前期數(shù)據(jù)中篩選出與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的7個SNPs位點，其中ESR1為g.76097125C>T和g.76139051A>G位點，TENM1為g.17236451G>C、g.17333655C>T、g.17372494A>G和g.17586866T>C，THEM4為g.101275605G>A位點。采用 MassARRAY?SNP分型技術(shù)，在云上黑山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊群體中對候選基因的基因型進行檢測。MassARRAY?SNP分型技術(shù)是Agena公司推出的一個基因分析工具，通過引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏、可靠的MALDITOF 質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)基因分型檢測，實驗設(shè)計非常靈活，分型結(jié)果準確性高[11]。分型后分析其多態(tài)性與山羊繁殖性狀的相關(guān)性，以期為山羊的高繁殖力分子標記輔助選擇育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品試驗用山羊飼養(yǎng)條件和生長環(huán)境一致，年齡2～5歲，共采集768只山羊(云上黑山羊544只、濟寧青山羊133只、遼寧絨山羊91只)的血液。該試驗將濟寧青山羊視為高繁殖力群體，將遼寧絨山羊視為低繁殖力群體[9-10]。云上黑山羊有至少1胎產(chǎn)羔記錄，部分有初生窩重和斷奶窩重(3月齡)記錄。所有山羊均采用頸靜脈采血(10 mL/只)，使用EDTA-K2抗凝，-20 ℃下保存。試驗山羊品種及其采樣信息見表1。

表1 試驗山羊品種及其采樣信息Table 1 The breeds of test goats and their sampling information

1.2 血液DNA的提取使用酚氯仿法提取基因組DNA，采用Nano Drop2000檢測DNA樣本濃度，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

1.3 基因分型采用Sequenom MassARRAY?SNP分型技術(shù)對ESR1、TENM1和THEM4基因突變位點進行檢測，相關(guān)引物信息見表2。

表2 引物序列Table 2 Sequences of the primers

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析使用Microsoft Excel 2021軟件統(tǒng)計山羊ESR1、TENM1和THEM4 突變位點的基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)，并進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。使用SPSS 25軟件進行單因素方差分析，采用Tukey法進行多重比較，對山羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析。試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1ESR1 多態(tài)性分析利用Sequenom MassARRAY?SNP對768只山羊血液DNA進行基因分型。結(jié)果顯示，ESR1 g.76097125C>T和g.76139051A>G位點在云上黑山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊中存在多態(tài)性，其中g(shù).76097125C>T位點基因型為CC、CT、TT型，g.76139051A>G位點基因型為AA、AG、GG型(圖1)。

圖1 ESR1 位點分型結(jié)果Fig.1 The locus typing results of ESR1 gene

統(tǒng)計濟寧青山羊(高繁)和遼寧絨山羊(低繁)中ESR1 2個位點的基因型頻率和基因頻率，結(jié)果見表3～4。ESR1 g.76097125C>T位點的基因型頻率和基因頻率在高繁山羊和低繁山羊群體之間差異極顯著(P<0.01)。g.76097125C>T位點在高繁群體和低繁群體的優(yōu)勢基因型為CC，優(yōu)勢等位基因為C；g.76139051A>G位點的基因型頻率和基因頻率在高繁山羊和低繁山羊群體之間差異不顯著(P>0.05)。

表3 ESR1、TENM1和THEM4 7個多態(tài)位點在高繁、低繁山羊品種中的基因型頻率

表4 ESR1、TENM1和THEM4 7個多態(tài)位點在高繁、低繁山羊品種中的基因頻率

群體遺傳學統(tǒng)計表明，ESR1 g.76097125C>T位點在濟寧青山羊和遼寧絨山羊中為低度多態(tài)(PIC<0.25)，在云上黑山羊中為中度多態(tài)(0.25G在云上黑山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊中為中度多態(tài)(0.25T位點在濟寧青山羊中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(P<0.05)，在遼寧絨山羊和云上黑山羊中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)；g.76139051A>G在云上黑山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)(表5)。

2.2TENM1基因多態(tài)性分析基因分型結(jié)果表明，TENM1 4個候選SNPs位點在3個群體中均存在多態(tài)性(圖2)。如表3～4所示，TENM1 g.17372494A>G、g.17586866T>C位點的基因型頻率和基因頻率在高繁和低繁山羊群體之間差異顯著(P<0.05)，但TENM1 g.17236451G>C和g.17333655C>T位點的基因型頻率和基因頻率在高繁和低繁山羊群體間差異不顯著(P>0.05)。

圖2 TENM1 位點分型結(jié)果Fig.2 The locus typing results of TENM1 gene

群體遺傳學統(tǒng)計表明，TENM1 g.17333655C>T位點在云上黑山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊中為低度多態(tài)(PIC<0.25)，TENM1基因其余位點多態(tài)性為0.01～0.36。卡方檢驗結(jié)果表明，TENM1 g.17236451 G>C和g.17586866 T>C位點在云上黑山羊和遼寧絨山羊中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)(表5)。

2.3THEM4 多態(tài)性分析基因分型結(jié)果表明，THEM4 g.101275605 G>A位點在3個群體中均存在多態(tài)性(圖3)。如表3～4所示，THEM4 g.101275605 G>A位點的基因型頻率和基因頻率在高繁和低繁山羊群體之間差異均達到顯著水平(P<0.05)，g.101275605 G>A位點在3個群體中只有GG和GA 2個基因型，其中GG為優(yōu)勢基因型，G為優(yōu)勢基因。

群體遺傳學統(tǒng)計分析表明，THEM4 g.101275605 G>A位點在云上黑山羊、濟寧青山羊、遼寧絨山羊中均為低度多態(tài)(PIC<0.25)。卡方檢驗結(jié)果表明，THEM4 g.101275605 G>A在云上黑山羊、濟寧青山羊、遼寧絨山羊中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)(表5)。

圖3 THEM4 位點分型結(jié)果Fig.3 The locus typing results of THEM4 gene

2.4 候選SNPs位點與云上黑山羊繁殖性狀的相關(guān)性分析由表6可知，ESR1 g.76097125C>T位點CT和TT型山羊的初生窩重顯著高于CC型(P<0.05)；TENM1 g.17236451G>C位點GC型山羊的產(chǎn)羔數(shù)和斷奶窩重顯著高于GG型(P<0.05)；TENM1 g.17333655C>T位點CC型山羊的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CT型(P<0.05)。其余SNPs位點多態(tài)性與云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)、初生窩重和斷奶窩重之間無顯著相關(guān)(P>0.05)。

表5 ESR1、TENM1和THEM4 7個多態(tài)位點在不同山羊品種中的群體遺傳學分析Table 5 The population genetic analysis of 7 polymorphic sites of ESR1,TENM1 and THEM4 genes in different goat breeds

表6 ESR1、TENM1和THEM4 基因?qū)υ粕虾谏窖虍a(chǎn)羔性能的影響Table 6 Effects of ESR1,TENM1 and THEM4 genes on the lambing performance of Yunshang Black Goat

3 討論

ESR1 編碼的雌激素受體1與雌激素結(jié)合后，在雌性繁殖周期中卵泡的生長發(fā)育發(fā)揮著重要的作用。研究表明，ESR基因與小尾寒羊和湖羊的多羔性狀密切相關(guān)[12-14]。劉欣[15]研究發(fā)現(xiàn)卵泡期成年母牛ESR1 在卵巢中表達量最高、在子宮中表達量最低。白淑等[16]使用免疫組織和熒光定量技術(shù)檢測濟寧青山羊出生后發(fā)育過程中雌激素受體在子宮的定位及表達，發(fā)現(xiàn)ESR1在子宮腔上皮、腺上皮、基質(zhì)、血管內(nèi)皮和平滑肌細胞胞核中均有表達，證實了ESR1參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜與肌層的增殖和分化。將雌性小鼠的ESR基因敲除后，ESR缺陷雌性小鼠出現(xiàn)促黃體生成素調(diào)節(jié)紊亂、卵巢不排卵等現(xiàn)象，進而影響了小鼠的生育能力[17]。將ESR1 過表達可能導致卵泡閉鎖[18]?？傮w來看，ESR1 可能對山羊的繁殖有一定的影響。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)云上黑山羊群體中ESR1 g.76097125C>T位點TT型和CT型山羊的初生窩重高于CC型，因此推測該位點C>T突變可能對于云上黑山羊群體而言是一個優(yōu)良的突變，可能會導致羔羊初生窩重增加。TENM1屬于Tenm/Odz基因跨膜蛋白家族，目前關(guān)于TENM1 對山羊繁殖的影響研究較少。研究表明，TENM1 的缺失可能影響生殖系統(tǒng)的發(fā)育，在線蟲中TENM1被證實是早期胚胎發(fā)生、生殖細胞發(fā)育、性腺遷移和表皮形態(tài)發(fā)生所必需的[19-20]。該研究結(jié)果表明，TENM1 g.17236451G>C和g.17333655C>T位點的多態(tài)性與云上黑山羊的產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)，其中g(shù).17236451G>C位點GC型山羊的產(chǎn)羔數(shù)比GG型高0.131，G>C的突變?yōu)橛欣诋a(chǎn)羔的突變；g.17333655C>T位點CC型山羊產(chǎn)羔數(shù)比CT型高0.190，C>T的突變導致產(chǎn)羔數(shù)的下降，為不利的突變。綜上所述，TENM1基因g.17236451G>C和g.17333655C>T位點可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標記。

4 結(jié)論

該研究結(jié)果表明，TENM1基因g.17236451G>C和g.17333655C>T位點與云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)存在顯著相關(guān)，可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標記。ESR1基因g.76097125C>T位點與云上黑山羊初生窩重存在顯著相關(guān)，可作為云上黑山羊初生窩重選擇的潛在分子標記。