冷雪嬌，闞宏飛，吳沁航，李存玉，鄭云楓，彭國(guó)平

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤，是威脅女性健康的主要疾病之一[1]。造成宮頸癌的因素多種多樣，但最為主要的原因是人乳頭瘤病毒(HPV)感染，從HPV感染發(fā)展為宮頸癌需要幾年至數(shù)十年時(shí)間，在此過程中會(huì)發(fā)生宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)，相當(dāng)于 “癌前”階段[2-3]，此階段是預(yù)防宮頸癌發(fā)生的重要窗口期。目前，對(duì)CIN1患者的治療方法是定期檢查和隨訪，對(duì)CIN2、CIN3患者的治療方法是采用冷刀錐切術(shù)或環(huán)形電切術(shù)。然而，手術(shù)治療會(huì)對(duì)人體造成永久性損傷[4-5]，導(dǎo)致長(zhǎng)期生殖系統(tǒng)疾病[6]。藥物治療CIN可避免手術(shù)治療引起的不良反應(yīng)，防止宮頸癌的發(fā)生。因此，研究治療CIN的藥物具有十分重要的意義。

丹參具有多種藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤和腦血管保護(hù)作用[7-8]。丹酚酸是丹參中最重要的生物活性成分之一。丹酚酸A(SAA)是丹參的親水性成分之一，具有多種藥理活性，包括抗炎[9]、抗氧化[10]、心臟保護(hù)[11]、抗病毒和抗腫瘤(包括抑制宮頸癌細(xì)胞)作用[12-14]。氧化槐定堿(OSR)是從苦豆子中提取的生物堿，已被證明對(duì)缺血性腦損傷具有保護(hù)作用[15]。此外，OSR還具有多種藥理活性，包括抗炎[16]、抗氧化應(yīng)激[17]、抗病毒和抗腫瘤作用[18-19]。

有研究發(fā)現(xiàn)，SAA、OSR聯(lián)合用藥可協(xié)同抑制CIN細(xì)胞(H8細(xì)胞)，其最佳聯(lián)合用藥比為1∶2，聯(lián)合用藥指數(shù)(CI)值為0.59，SAA、OSR對(duì)H8細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別為(1.87±0.37)μmol/L和(3.73±0.74)μmol/L[20]。本研究選擇2 μmol/L SAA、4 μmol/L OSR、2 μmol/L SAA 聯(lián)合 4 μmol/L OSR處理H8細(xì)胞，通過Hochest33342染色實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期測(cè)定、蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)研究了SAA、OSR聯(lián)合用藥對(duì)H8細(xì)胞的協(xié)同作用機(jī)制，以期為SAA、OSR聯(lián)合治療宮頸癌前病變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 SAA(批號(hào)Z23D10X106625)、OSR(批號(hào) Y06S10W97027)均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，H8細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供，RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào) 8121105)購(gòu)自HyClone中國(guó)公司，胎牛血清(批號(hào)42G9285K)、0.25%乙二胺四乙酸胰酶(批號(hào)2186974)、磷酸鹽緩沖液(PBS,批號(hào)8121037)、雙抗(批號(hào)2199843)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，二甲基亞砜(批號(hào)RNBJ6688)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Hochest33342(批號(hào)40731ES10)購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法凝膠制備試劑盒(批號(hào)AR0138)、電泳緩沖液(批號(hào)AR1146)、轉(zhuǎn)膜緩沖液(批號(hào)AR1151)、RIPA 裂解液(批號(hào) AR0105)、蛋白酶抑制劑(批號(hào)AR1182)、BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)AR0146)、蛋白上樣緩沖液(批號(hào)AR1112)、彩色預(yù)染蛋白Marker (批號(hào)AR1113)、洗滌緩沖液TBST (批號(hào)AR0195-10)、電化學(xué)發(fā)光試劑(ECL,批號(hào)AR1196)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，細(xì)胞周期蛋白B1(CyclinB1)抗體(批號(hào)A00745-1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶-1(CDK1)抗體(批號(hào)BA0027-2)、B細(xì)胞淋巴相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(批號(hào)A00183)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)抗體(批號(hào)A00040-2)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved Caspase-3)抗體(批號(hào)BM3937)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(批號(hào)BM0627)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2儀器 HERAcell 150i型細(xì)胞培養(yǎng)孵箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，TS2-S-SM型倒置生物顯微鏡購(gòu)自尼康(Nikon)中國(guó)有限公司，LDZ5型臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自北京雷勃爾離心機(jī)有限公司，SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司，DYY-6C型電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司，灌膠、垂直電泳、轉(zhuǎn)印裝置、Tanon5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)均購(gòu)自上海天能科技有限公司，DMI3000B型倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡(Leica)公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) H8細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞形態(tài)觀察 將H8細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按2×105個(gè)/mL接種于6孔板，每孔1 mL，置于37 ℃、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，給藥處理后直接放于倒置顯微鏡下觀察H8細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況并拍照。

1.2.3Hochest33342染色法觀察細(xì)胞凋亡 H8細(xì)胞用胰蛋白酶消化后離心收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以2×105個(gè)/孔接入6孔板中孵育 24 h后換液。SAA、OSR及其聯(lián)合用藥3個(gè)處理組和對(duì)照組分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h，經(jīng)處理后棄培養(yǎng)基，用無菌的PBS清洗2～3次。每孔添加1 mL Hochest33342染液，避光孵育20～30 min，用無菌的PBS清洗2～3次，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和染色情況，并拍照。Hochest33342能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，并能與細(xì)胞DNA結(jié)合。Hochest33342與細(xì)胞DNA結(jié)合染色后活細(xì)胞呈深藍(lán)色，正常凋亡細(xì)胞呈亮藍(lán)色[21-22]。

1.2.4細(xì)胞周期測(cè)定 以4×105個(gè)/孔接種于6孔板，對(duì)照組和3個(gè)處理組細(xì)胞黏附后用藥物處理24 h。胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后用4 ℃預(yù)冷PBS清洗，吸盡上清液后用75%預(yù)冷乙醇與細(xì)胞混合，斡旋振蕩后置于4 ℃下冰箱固定過夜，1 000 r/min離心5 min后用預(yù)冷PBS清洗，離心，棄上清液，向細(xì)胞懸浮液中加入0.5 mL含有RNA酶A的碘化丙啶染色液。所有樣品在37 ℃下避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。使用Kaluza Analysis軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。細(xì)胞周期分為有絲分裂期(M期)和細(xì)胞間期，細(xì)胞間期又分為休眠期(G0期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)，整個(gè)細(xì)胞周期可表示為G1期→S期→G2期→M期[23-24]。細(xì)胞DNA周期檢測(cè)可測(cè)定細(xì)胞各時(shí)期狀況，進(jìn)而反映細(xì)胞增殖情況[25]。

1.2.5蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 以4×105個(gè)/孔接種于6孔板，對(duì)照組和3個(gè)處理組細(xì)胞黏附后用藥物處理24 h。胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，蛋白樣品用5%分離膠，12%濃縮膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法電泳，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(0.22 μm)上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗，含吐溫-20的PBS(PBST)洗膜后加入二抗，室溫孵育1.5 h，再用PBST洗膜3次，每次15 min，ECL工作液于印跡膜上30～60 s，吸干發(fā)光液，置印跡膜于成像分析儀自動(dòng)成像，應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值及蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1各組H8細(xì)胞形態(tài)比較 與對(duì)照組比較，各處理組H8細(xì)胞形態(tài)均變小、變圓，且黏附力均下降。聯(lián)合用藥組H8細(xì)胞24 h后細(xì)胞形態(tài)更小、更圓，且黏附力更差，細(xì)胞幾乎快脫落。SAA、OSR聯(lián)合用藥對(duì)H8細(xì)胞形態(tài)改變具有協(xié)同增效作用。見圖1。

圖1 各組H8細(xì)胞形態(tài)比較(顯微鏡，200×)

2.2各組H8細(xì)胞凋亡情況比較 與對(duì)照組比較，處理組H8細(xì)胞亮藍(lán)色細(xì)胞數(shù)量均明顯增加，聯(lián)合用藥組H8細(xì)胞亮藍(lán)色細(xì)胞數(shù)量明顯高于SAA組和OSR組，說明SAA、OSR聯(lián)合用藥可協(xié)同促進(jìn)H8細(xì)胞凋亡。見圖2。

圖2 各組H8細(xì)胞凋亡情況比較(Hochest33342染色法，100×)

2.3各組H8細(xì)胞周期比較 與對(duì)照組比較，OSR組、聯(lián)合用藥組H8細(xì)胞處理24 h后G2期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，G1期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表示H8細(xì)胞被阻滯在G2/M期。SAA對(duì)H8細(xì)胞周期調(diào)控?zé)o明顯影響，但可協(xié)同OSR調(diào)控H8細(xì)胞周期。聯(lián)合用藥組H8細(xì)胞G2期細(xì)胞增加和G1期細(xì)胞減少較SAA組和OSR組更為顯著，表明SAA、OSR可協(xié)同調(diào)控H8細(xì)胞周期，將H8細(xì)胞阻滯在G2/M期。見圖3。

注：A.各組H8細(xì)胞周期圖；B. 各組H8細(xì)胞各周期的細(xì)胞數(shù)量占比比較；與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與聯(lián)合用藥組比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.4各組H8細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，SAA、OSR均可下調(diào)H8細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)。SAA、OSR聯(lián)合用藥導(dǎo)致Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，與SAA組、OSR組比較，分別降低27%和49%。表明SAA、OSR聯(lián)合用藥可抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)H8細(xì)胞凋亡。見圖4。

注：A.各組H8細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B. 各組H8細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較；與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001；與聯(lián)合用藥組比較，dP<0.05。

3 討 論

造成CIN和宮頸癌發(fā)生的因素多種多樣，但最為主要的發(fā)病原因?yàn)镠PV感染[2-3]。HPV被大量復(fù)制擴(kuò)散后部分HPV-DNA整合入宿主染色體內(nèi)，誘發(fā)基因突變，激活病毒癌基因，造成癌蛋白過度表達(dá)，干擾正常細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡，破壞機(jī)體免疫，使病毒長(zhǎng)期持續(xù)感染，發(fā)生宮頸上皮細(xì)胞不典型增生，產(chǎn)生CIN，繼續(xù)發(fā)展則造成宮頸癌變[26]。及時(shí)治療CIN能預(yù)防宮頸癌的發(fā)生，然而，目前治療CIN的主要方法依然為手術(shù)治療，有學(xué)者開展的治療CIN藥物的研究發(fā)現(xiàn)，SAA、OSR可抑制H8細(xì)胞，且二者對(duì)其具有協(xié)同增效的抑制作用[20]。為探索SAA、OSR聯(lián)合用藥的作用機(jī)制，本研究對(duì)SAA、OSR及其聯(lián)合用藥開展了研究，結(jié)果顯示，SAA、OSR聯(lián)合用藥可通過調(diào)節(jié)H8細(xì)胞周期，將H8細(xì)胞阻滯在G2/M期，阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂，抑制細(xì)胞增殖，且SAA、OSR聯(lián)合用藥對(duì)H8細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用明顯優(yōu)于單一藥物，表明SAA、OSR聯(lián)合用藥對(duì)H8細(xì)胞周期具有協(xié)同調(diào)節(jié)作用。

SAA、OSR可協(xié)同促進(jìn)H8細(xì)胞凋亡，但其共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡的原因尚不清楚。線粒體是細(xì)胞凋亡發(fā)生的主要場(chǎng)所，線粒體能通過釋放各種刺激信號(hào)調(diào)節(jié) Bcl-2 蛋白(抗凋亡蛋白)促使 Bax 蛋白(促凋亡蛋白)表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。Caspase-3是Caspase蛋白家族成員之一，可激活凋亡信號(hào)的傳遞，是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白[27-28]?；罨蟮腃aspase-3(Cleaved Caspase-3)能破壞細(xì)胞正常功能，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[29]。本研究結(jié)果顯示，SAA、OSR均能通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)H8細(xì)胞凋亡，與單獨(dú)用藥比較，SAA、OSR聯(lián)合用藥對(duì)H8細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)的抑制作用更為顯著。因此，SAA、OSR聯(lián)合用藥可通過線粒體途徑協(xié)同促進(jìn)H8細(xì)胞凋亡。

綜上所述，SAA、OSR聯(lián)合用藥可通過協(xié)同調(diào)節(jié)H8細(xì)胞周期，將細(xì)胞阻滯在G2/M期，抑制H8細(xì)胞增殖，通過下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)促進(jìn)H8細(xì)胞凋亡。