劉佳佳 蘇秋東 伊 瑤 畢勝利

CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide, CpG ODN)是含非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸，能與B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面的TLR9受體結(jié)合[1]。通過激活下游多種信號(hào)通路，誘發(fā)免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的先天性免疫應(yīng)答及Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答[2, 3]。CpG ODN強(qiáng)烈的免疫激活能力，使其在腫瘤治療方面表現(xiàn)出極大的研究?jī)r(jià)值[4]。研究表明，CpG ODN單獨(dú)使用時(shí)即可殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，但其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答強(qiáng)度尚不足以消除腫瘤，而將CpG ODN與其他免疫增強(qiáng)劑或利用基因載體進(jìn)行靶向給藥的方式可以顯著增強(qiáng)其腫瘤治療效果[5～8]。

細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptide，CPP)是一類具有細(xì)胞膜穿透功能的小分子多肽，長(zhǎng)度通常為6～30個(gè)氨基酸，結(jié)構(gòu)上富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸[9]。CPP作為基因遞送載體可以攜帶多種生物大分子(蛋白、核酸、藥物、納米粒子等)進(jìn)入細(xì)胞，在基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等研究領(lǐng)域具有很大的研究?jī)r(jià)值[10～12]。低分子量魚精蛋白(low molecular weight protamine，LMWP)是由天然魚精蛋白酶解后分離得到的一種陽(yáng)離子多肽，具有典型的穿膜肽結(jié)構(gòu)[13]。LMWP富含精氨酸，其自身帶有的正電荷能有效結(jié)合并壓縮帶負(fù)電的核酸形成穩(wěn)定的復(fù)合物[14]。同時(shí)LMWP攜帶核定位信號(hào)，有助于指導(dǎo)LMWP/核酸復(fù)合物向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，提高細(xì)胞內(nèi)化效果，是一種安全有效的基因遞送載體[15,16]。將LMWP作為載體介導(dǎo)抗腫瘤藥物遞送的研究已有報(bào)道，LMWP不僅能提高腫瘤治療效果，而且治療過程安全、不良反應(yīng)小[17,18]。

本研究以腫瘤靶向序列RGD修飾的LMWP多肽作為載體，利用LMWP對(duì)核酸的結(jié)合特性裝載CpG分子形成納米復(fù)合物，通過檢測(cè)其理化性質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)分布情況及對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，探討LMWP作為載體遞送CpG ODN的可能性，及其對(duì)提高CpG ODN腫瘤治療效果的作用。

材料與方法

1.試劑和儀器：CpG ODN和FAM修飾CpG ODN購(gòu)自蘇州泓迅生物科技股份有限公司；RGD-LMWP購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；Dulbeccco′s Modified Eagle′s Medium培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；DiD熒光染料購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純。紫外凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自廣州市明美光電技術(shù)有限公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、Multiskan GO多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Nano-ZS粒徑分析儀購(gòu)自英國(guó)Malvern公司。

2.細(xì)胞株：人子宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)為中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所保存。采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3.RGD-LMWP/CpG復(fù)合物的制備：將RGD-LMWP和CpG凍干粉分別用去離子水溶解，CpG質(zhì)量濃度恒定為0.2mg/ml，按照RGD-LMWP與CpG質(zhì)量比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1的比例，將CpG加入到等體積不同質(zhì)量濃度的RGD-LMWP溶液中，渦旋混勻后室溫靜置30min，即獲得不同質(zhì)量比的RGD-LMWP/CpG復(fù)合物。

4.RGD-LMWP/CpG復(fù)合物的凝膠阻滯分析：采用瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)分析RGD-LMWP對(duì)CpG的包裹能力。稱取適量瓊脂糖制備1%瓊脂糖凝膠(0.5μg/ml)，將制得的不同質(zhì)量比RGD-LMWP/CpG復(fù)合物與上樣緩沖液混勻后進(jìn)行電泳(90V，20min)，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

5.RGD-LMWP/CpG復(fù)合物的理化性質(zhì)表征：取2ml制得的不同質(zhì)量比RGD-LMWP/CpG復(fù)合物，使用激光粒徑分析儀對(duì)復(fù)合物的粒徑大小與zeta電位進(jìn)行檢測(cè)。

6.腫瘤細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于24孔板中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。將RGD-LMWP與帶有FAM熒光基團(tuán)修飾的CpG按質(zhì)量比為3∶1制備復(fù)合物，每孔加入含5μg CpG的復(fù)合物，在培養(yǎng)箱中孵育4h。棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)漂洗2次后，加入DiD熒光染料，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育30min，棄去培養(yǎng)基，用PBS漂洗2次后，使用倒置熒光顯微鏡下觀察熒光的分布情況。

7.抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8法評(píng)估復(fù)合物的抗腫瘤細(xì)胞增殖能力。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于96孔板中(細(xì)胞密度為103個(gè)/孔)，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁。用DMEM培養(yǎng)基對(duì)RGD-LMWP/CpG(質(zhì)量比為3∶1)復(fù)合物進(jìn)行倍比稀釋，保證CpG的質(zhì)量濃度梯度為6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml。吸去96孔板中的原培養(yǎng)液，用PBS漂洗2次后，加入稀釋好的復(fù)合物溶液100微升/孔，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，向每孔加入10μl CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育30min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm處的吸光度值，并按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As為實(shí)驗(yàn)孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測(cè)物質(zhì))；Ac為對(duì)照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、無待測(cè)物質(zhì))；Ab為空白孔(不含有細(xì)胞和待測(cè)物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8)。

結(jié) 果

1.RGD-LMWP多肽的純度鑒定：采用固相合成法合成RGD-LMWP多肽(南京金斯瑞生物科技有限公司)，高效液相色譜分析以及質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，合成RGD-LMWP多肽的相對(duì)分子質(zhì)量為3656.23kDa，純度為95.2%。對(duì)其進(jìn)行溶解度測(cè)試，RGD-LMWP多肽可溶于超純水和PBS，詳見圖1、圖2。

圖1 RGD-LMWP的高效液相色譜分析

圖2 RGD-LMWP的質(zhì)譜分析

2.RGD-LMWP/CpG復(fù)合物的凝膠阻滯結(jié)果：凝膠阻滯分析可以反映RGD-LMWP對(duì)CpG的包裹壓縮能力。游離CpG可與核酸染料結(jié)合，隨電場(chǎng)發(fā)生遷移，在紫外線照射下可觀察到明顯的熒光條帶；RGD-LMWP帶正電，可與CpG通過靜電吸附縮合成穩(wěn)定的復(fù)合物，阻止CpG與熒光染料的結(jié)合。當(dāng)RGD-LMWP/CpG的質(zhì)量比<3時(shí)可觀察到條帶，說明CpG未完全被縮合，體系中仍有游離CpG在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移；隨著RGD-LMWP/CpG質(zhì)量比的增大，LMWP對(duì)CpG的縮合能力增強(qiáng)，可遷移的游離CpG逐漸減少；當(dāng)質(zhì)量比≥3時(shí)，CpG完全被魚精蛋白包裹，無遷移現(xiàn)象發(fā)生，故觀察不到條帶，詳見圖3。

圖3 RGD-LMWP/CpG復(fù)合物的凝膠阻滯電泳圖泳道1.CpG；泳道2～6.RGD-LMWP/CpG的質(zhì)量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1

3.RGD-LMWP/CpG復(fù)合物的表征：復(fù)合物的粒徑和表面電位對(duì)目的基因能否有效轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞具有重要的參考意義。通常粒徑為100～200nm，表面單位帶正電荷的顆粒更有利于細(xì)胞的內(nèi)化[19]。采用激光粒徑分析儀對(duì)不同質(zhì)量比RGD-LMWP/CpG合物的粒徑、zeta電位及多分散系數(shù)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，隨著RGD-LMWP/CpG質(zhì)量比的升高，復(fù)合物的粒徑由112.1±0.5nm升高至135.2±2.4nm，呈逐漸增大趨勢(shì)；而zeta電位的變化趨勢(shì)不明顯，在40mV左右。這表明RGD-LMWP和CpG可以通過靜電作用結(jié)合形成復(fù)合物，并在溶液中均勻分布，而且該復(fù)合物還具備被細(xì)胞攝取的有利條件。綜合考慮以上參數(shù)以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)劑量需求，本研究最終選擇以質(zhì)量比3∶1形成的RGD-LMWP/CpG復(fù)合物(粒徑119.7±1.2nm，zeta電位47.9±0.5mV)作為研究對(duì)象繼續(xù)開展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),詳見表1和圖4。

圖4 不同質(zhì)量比RGD-LMWP/CpG復(fù)合物粒徑和電位的差異A.粒徑大小；B.zeta電位

表1 不同納米復(fù)合物的粒徑分布和zeta電位比較

4.腫瘤細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)：將帶有FAM熒光基團(tuán)修飾的游離CpG和RGD-LMWP/CpG復(fù)合物分別作用于HeLa細(xì)胞，根據(jù)HeLa細(xì)胞內(nèi)是否有綠色熒光以及熒光強(qiáng)度進(jìn)行細(xì)胞攝取效率的評(píng)價(jià)。倒置熒光顯微鏡結(jié)果顯示，CpG組HeLa細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光較少，說明HeLa細(xì)胞對(duì)游離CpG的攝取效率較低；RGD-LMWP/CpG(3∶1)復(fù)合物組的細(xì)胞內(nèi)分布有大量綠色熒光，說明在細(xì)胞穿膜肽RGD-LMWP的轉(zhuǎn)運(yùn)下，腫瘤細(xì)胞對(duì)CpG的攝取效率顯著增強(qiáng)，詳見圖5。

圖5 HeLa細(xì)胞對(duì)各組藥物的攝取情況(×400)A.游離CpG組；B.RGD-LMWP/CpG復(fù)合物組

5.抑制腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8法比較不同濃度的RGD-LMWP/CpG(3∶1)復(fù)合物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，將RGD-LMWP多肽單獨(dú)作用于HeLa細(xì)胞時(shí)，隨RGD-LMWP使用劑量的升高，HeLa細(xì)胞的增殖能力受到輕微影響，但并未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，說明RGD-LMWP是一種相對(duì)安全的基因載體。與單獨(dú)使用CpG比較，RGD-LMWP/CpG復(fù)合物能夠顯著抑制腫瘤HeLa細(xì)胞的增殖，且使用劑量越高，抑制效果越明顯。當(dāng)CpG使用劑量≤50μg/ml時(shí)，復(fù)合物組和游離CpG組的細(xì)胞存活率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)CpG使用劑量>50μg/ml時(shí)，復(fù)合物組和游離CpG組的細(xì)胞存活率開始出現(xiàn)差異，且劑量達(dá)到100μg/ml時(shí)，兩組的細(xì)胞存活率分別為31.93%和80.70%(P<0.01)。這些結(jié)果表明，RGD-LMWP與CpG形成復(fù)合物后，可以有效地將CpG遞送至腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤活性，是一種相對(duì)安全有效的給藥系統(tǒng)，詳見圖6。

圖6 RGD-LMWP/CpG復(fù)合物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用

討 論

LMWP作為一種天然非病毒載體，可利用其跨膜功能攜帶多種外源性分子進(jìn)入細(xì)胞，且不影響所攜帶分子的生物活性[17]。多項(xiàng)研究肯定了LMWP作為載體介導(dǎo)基因給藥的優(yōu)勢(shì)，利用LMWP遞送FER-siRNA可有效抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[20]；LMWP還可以通過多種跨膜途徑增強(qiáng)藥物細(xì)胞內(nèi)遞送和腫瘤穿透的效率從而改善耐藥型癌癥的治療效果[21]。為提高CpG的抗腫瘤能力，本研究利用LMWP的核酸結(jié)合特性，將其與CpG作用形成納米復(fù)合物，并對(duì)復(fù)合物的腫瘤治療效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)。同時(shí)，為提高轉(zhuǎn)運(yùn)的靶向性，本研究對(duì)LMWP進(jìn)行了RGD(精氨酸、甘氨酸和天門冬氨酸)修飾，RGD序列可以靶向于整合素過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞或腫瘤內(nèi)皮血管，是一種常見的提高腫瘤藥物遞送效率的修飾方法[22,23]。

首先，為驗(yàn)證RGD-LMWP和CpG能否通過靜電引力結(jié)合成復(fù)合物，本研究采用凝膠電泳對(duì)RGD-LMWP和CpG的結(jié)合能力進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，當(dāng)RGD-LMWP/CpG的質(zhì)量比≥3時(shí)，已經(jīng)檢測(cè)不到游離CpG的存在，說明通過簡(jiǎn)單的靜電結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)RGD-LMWP對(duì)CpG的完全縮合。對(duì)復(fù)合物粒徑、zeta電位和多分散系數(shù)的檢測(cè)說明RGD-LMWP與CpG結(jié)合后不僅能以顆粒狀態(tài)均勻存在，且具備被細(xì)胞攝取的有利條件。一方面，RGD-LMWP/CpG復(fù)合物表面攜帶的正電荷有利于其與細(xì)胞膜表面的負(fù)電基團(tuán)結(jié)合而黏附于細(xì)胞膜上；另一方面，RGD-LMWP/CpG復(fù)合物的粒徑優(yōu)勢(shì)100～200nm以及LMWP的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力有利于其通過多種途徑被細(xì)胞內(nèi)化，進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)物質(zhì)活性、評(píng)價(jià)藥效的基礎(chǔ)內(nèi)容。將得到的RGD-LMWP/CpG(3∶1)復(fù)合物(粒徑119.7±1.2nm，zeta電位47.9±0.5mV)作用于腫瘤細(xì)胞分析其對(duì)細(xì)胞攝取效率和腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。與游離CpG比較，RGD-LMWP/CpG復(fù)合物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的能力更強(qiáng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用更明顯，這說明RGD-LMWP通過與CpG結(jié)合形成復(fù)合物，利用復(fù)合物的粒徑和電位優(yōu)勢(shì)可以有效地將CpG輸送至腫瘤細(xì)胞中，繼而發(fā)揮抗腫瘤作用。但是，目前尚不清楚CpG是以與RG -LMWP結(jié)合成復(fù)合物的狀態(tài)還是從復(fù)合物中分離出來的狀態(tài)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的，更多細(xì)胞動(dòng)力學(xué)機(jī)制仍需開展進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究成功采用陽(yáng)離子多肽RGD-LMWP靜電結(jié)合CpG的方法制備得到了RGD-LMWP/CpG復(fù)合物，該復(fù)合物能實(shí)現(xiàn)CpG向腫瘤細(xì)胞內(nèi)的有效傳遞，并發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，為增強(qiáng)CpG的抗腫瘤效果提供了新的研究思路。