李 皓 陳悠然 王嘉君 吳蓉洲

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是各種因素導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈處于急性、持續(xù)性的缺血缺氧狀態(tài)所出現(xiàn)的心肌組織壞死[1]。隨后引起心室容積增大及左心功能受損，兩者不斷相互促進(jìn)與進(jìn)展，影響遠(yuǎn)期預(yù)后，給患者的生命和生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響[2～4]。因此探索心臟的保護(hù)機(jī)制，尋找早期且有效阻止心肌梗死后心臟重塑的發(fā)生、發(fā)展的干預(yù)方式，對改善AMI患者的生活質(zhì)量及降低病死率有重要臨床意義。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)是富集于魚肝油及海藻的多不飽和脂肪酸，為人體所必需，但人體無法自我合成，主要從外部攝取以補(bǔ)充人體所需[5]。

既往研究發(fā)現(xiàn)，在大腦中動(dòng)脈栓塞之前，飲食中補(bǔ)充DHA可顯著減少腦梗死面積，同時(shí)有研究證實(shí)，DHA能通過自噬改善缺血導(dǎo)致的腎功能障礙[6，7]。一般情況下，心臟中存在低水平的自噬，當(dāng)發(fā)生缺氧、能量供應(yīng)不足或病原體入侵等應(yīng)激情況時(shí)，則自噬被過度激活[8,9]。因此推測DHA可以通過自噬改善大鼠因急性心肌梗死導(dǎo)致的心肌損傷。本研究通過左前降支冠脈結(jié)扎法構(gòu)建大鼠急性心肌梗死模型，采用DHA預(yù)處理，引入自噬流阻滯劑氯喹(chloroquine, CQ)，探討DHA在AMI中的作用及機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要實(shí)驗(yàn)試劑：無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級雄性8周齡SD(sprague-dawley，SD)大鼠96只，體質(zhì)量為180～200g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心恒溫恒濕環(huán)境(溫度為24±1℃，濕度為45%±10%)，用于制備AMI模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK(浙)2015-0009。DHA購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。CQ購自美國Sigma-Aldrich公司。Dorsomorphin(Compound C)購自美國Selleck Chemicals公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗購自北京安必維抗體技術(shù)有限公司，微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3(MAP1LC3，LC3，#14600-1-AP)一抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；SQSTM1/p62(Sequestosome 1，SQSTM1/p62，#23214)一抗購自美國Cell Signaling Technology公司。二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme, CK-MB)試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)分組及造模：96只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(sham組)、急性心肌梗死組(AMI組)、DHA預(yù)處理組(AMI+DHA組)和DHA預(yù)處理+CQ聯(lián)合處理組(AMI+DHA+CQ組)，每組各24只。DHA術(shù)前40min腹腔注射，劑量為250mg/kg；CQ術(shù)前2h腹腔注射，劑量為50mg/kg。大鼠AMI模型的制備主要是采用2%的異氟烷氣體進(jìn)行麻醉，通過開胸后結(jié)扎大鼠心臟冠狀動(dòng)脈的左前降支分支，結(jié)扎后左心室前壁因缺血變灰白且心臟的搏動(dòng)減弱則說明結(jié)扎成功。關(guān)閉胸腔后將大鼠置于恒溫墊上，待復(fù)蘇后即造模成功。

3.心功能指標(biāo)：大鼠AMI造模4周后，采用Vevo 2100超聲診斷儀進(jìn)行大鼠心臟超聲的檢測。每組按隨機(jī)數(shù)字表法取6只大鼠，通過配套軟件測量左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左心室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)。連續(xù)檢測5個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

4.心肌纖維化程度：大鼠AMI造模4周后，每組按隨機(jī)數(shù)字表法取6只大鼠心臟光學(xué)相干斷層成像(optical coherence tomography，OCT)包埋，制備心肌組織冷凍切片。通過Masson三色染色試劑盒染色，麗春紅4min，ddH2O清洗殘余染液；磷鉬酸3min，ddH2O清洗殘余染液；冰醋酸1min，ddH2O清洗殘余染液后甩干；苯胺藍(lán)30min，ddH2O清洗殘余染液，甩干；二甲苯Ⅰ5min；二甲苯Ⅱ5min；中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察切片中心肌組織纖維化部分。通過比較切片完整度、代表性從各個(gè)心臟組織所有切片中篩選出5張切片，分別拍取5張對應(yīng)區(qū)域的200倍視野圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算相應(yīng)的心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。

5.Western blot法檢測：大鼠AMI造模24h后，每組隨機(jī)取6只大鼠，取其心肌組織，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，取適量蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h后進(jìn)行一抗孵育，分別添加LC3(1∶1000)、p62(1∶1000)、GAPDH(1∶5000)4℃孵育過夜，及相應(yīng)的二抗(1∶5000)37℃孵育2h，洗膜后顯色、拍照并觀察各蛋白條帶灰度值，分別計(jì)算LC3-Ⅱ及p62蛋白相對表達(dá)量。

6.CK-MB檢測：大鼠AMI造模3天后，每組按隨機(jī)數(shù)字表法取6只大鼠，采用異氟烷麻醉，頸動(dòng)脈處取血4ml并靜置8h(4℃)，隨后3000r/min離心處理15min取上清液即可得到血清。按照雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒說明檢測各組大鼠血清CK-MB的含量。

結(jié) 果

1.DHA預(yù)處理提高AMI大鼠生存率：大鼠AMI造模4周后，采用Kaplan-Meier法分析其生存率，結(jié)果顯示，與AMI組比較，AMI+DHA組的生存率明顯升高(P<0.05)；與AMI+DHA組比較，AMI+DHA+CQ組的生存率降低(P<0.05)。提示DHA預(yù)處理可以提高AMI大鼠的生存率，而自噬抑制劑聯(lián)合干預(yù)后降低了DHA對大鼠的生存率的影響(圖1)。

圖1 Kaplan-Meier法分析各組大鼠生存率與sham組比較，*P<0.05；與AMI組比較，#P<0.05；與AMI+DHA組比較，△P<0.05

2.DHA預(yù)處理降低AMI大鼠血清CK-MB含量：大鼠AMI造模3天后，檢測血清CK-MB含量，結(jié)果顯示，與sham組比較，AMI組血清CK-MB含量明顯升高(P<0.05)；與AMI組比較，AMI+DHA組CK-MB含量顯著降低；AMI+DHA+CQ組較AMI+DHA組CK-MB含量回升(P<0.05)。提示DHA預(yù)處理可以減少AMI大鼠血清中心肌梗死標(biāo)志物CK-MB的含量，而自噬流抑制劑聯(lián)合干預(yù)后則削弱了DHA對CK-MB的降低作用(圖2)。

圖2 ELISA法檢測各組大鼠血清中CK-MB的含量與sham組比較，*P<0.05；與AMI組比較，#P<0.05；與AMI+DHA組比較，△P<0.05

3.DHA預(yù)處理影響AMI大鼠自噬指標(biāo)LC3-Ⅱ、p62表達(dá)水平：大鼠AMI造模24h后，檢測蛋白LC3及p62含量，與sham組比較，AMI組自噬體標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，自噬降解指標(biāo)p62蛋白水平降低(P<0.05)；在AMI+DHA組中，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加(P<0.05)，p62蛋白水平進(jìn)一步降低(P<0.05)；在AMI+DHA+CQ組中，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步顯著增加(P<0.05)，p62蛋白表達(dá)亦顯著回升(P<0.05)。提示DHA預(yù)處理可以進(jìn)一步激活自噬；聯(lián)合使用CQ后，心肌自噬流被阻斷(圖3)。

4.DHA預(yù)處理改善AMI大鼠心功能指標(biāo)：大鼠AMI造模4周后，采用心臟超聲評估心功能，結(jié)果顯示，與sham組比較，AMI組左心室前壁變薄，LVEF及LVFS明顯下降(P<0.05)；與AMI組比較，AMI+DHA組LVEF及LVFS顯著回升(P<0.05)，提示DHA預(yù)處理可改善AMI后心臟功能。與AMI+DHA組比較，AMI+DHA+CQ組LVEF及LVFS降低(P<0.05)。提示DHA預(yù)處理可改善AMI后心功能，而聯(lián)合使用自噬流抑制劑CQ后，DHA保護(hù)心功能的作用被逆轉(zhuǎn)(圖4)。

圖4 超聲心動(dòng)圖檢測各組大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)A.sham組；B.AMI組；C.AMI+DHA組；D.AMI+DHA+CQ組；E.各組大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)；F.各組大鼠心臟左心室短軸縮短率。與sham組比較，*P<0.05；與AMI組比較，#P<0.05；與AMI+DHA組比較，△P<0.05

5.DHA預(yù)處理改善AMI大鼠心肌纖維化程度：大鼠AMI造模4周后，采用Masson染色評估心肌梗死區(qū)及邊緣區(qū)膠原纖維沉積，結(jié)果顯示，sham組未見明顯膠原纖維沉積；AMI組心肌梗死區(qū)域CVF明顯增加(P<0.05)，與AMI組比較，AMI+DHA組心肌梗死邊緣區(qū)CVF顯著降低(P<0.05)，提示DHA預(yù)處理可改善大鼠AMI后的心肌纖維化程度。與AMI+DHA組比較，AMI+DHA+CQ組CVF增加(P<0.05)。提示DHA預(yù)處理可改善AMI后心肌纖維化程度，而聯(lián)合CQ干預(yù)后，此現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)。

討 論

AMI是一種危重心血管疾病，常伴心力衰竭、心律失常等嚴(yán)重并發(fā)癥。近年來，AMI的病死率總體呈上升態(tài)勢，將成為全球人口致死的主要原因之一，且其在青年群體中發(fā)生率逐漸增高，遠(yuǎn)期預(yù)后差[10～12]。溶栓及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)等治療方法的發(fā)展，使得AMI的存活率有所提升，但早期缺氧致心肌細(xì)胞死亡致使恢復(fù)期心室結(jié)構(gòu)重塑、心臟泵血功能受損，最終導(dǎo)致心力衰竭。以往對DHA的研究主要在大腦發(fā)育、視網(wǎng)膜成熟、腦部功能改善等方面。DHA是促進(jìn)大腦的結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)育和完善所必需的，通過影響神經(jīng)元細(xì)胞的生長和分化、細(xì)胞之間的信號傳遞等，從而在生理狀態(tài)以及疾病進(jìn)程中保護(hù)神經(jīng)功能[13～16]。近年來研究顯示，DHA在缺血性疾病，如大腦中動(dòng)脈栓塞、腦缺血再灌注損傷及缺血性腎衰竭等能發(fā)揮保護(hù)作用，但其在AMI中的具體作用機(jī)制未見報(bào)道[17～19]。

圖5 Masson染色檢測各組大鼠心肌纖維化程度(×200)A.sham組；B.AMI組；C.AMI+DHA；D.AMI+DHA+CQ組；E.各組大鼠心肌膠原容積分?jǐn)?shù)。與sham組比較，*P<0.05；與AMI組比較，#P<0.05；與AMI+DHA組比較，△P<0.05。心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)CVF(%)=膠原面積/總面積×100%

本研究通過構(gòu)建大鼠AMI模型，并給予DHA預(yù)處理，通過檢測血清CK-MB含量、心超評估心臟功能及Masson染色評估心肌纖維化，證實(shí)大鼠AMI模型制備成功，且在大鼠AMI模型中DHA預(yù)處理可以降低血清CK-MB含量，提高大鼠AMI后心臟射血分?jǐn)?shù)，改善心功能水平，降低心肌纖維化水平，發(fā)揮心臟保護(hù)效應(yīng)。但DHA發(fā)揮心肌保護(hù)作用的具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究明確。

自噬的適度激活可改善缺血、心律失常、心力衰竭等導(dǎo)致的心肌損害[19，20]。AMI過程中，心臟的供血突然中斷，細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，在缺血誘導(dǎo)的心肌損傷模型早期，適度的自噬能給心肌帶來幫助[21，22]。自噬典型過程主要包括自噬前體形成、自噬小體形成、自噬小體與溶酶體融合過程，以及自噬溶酶體的降解[23]。LC3是自噬的關(guān)鍵蛋白，與Atg5-Atg12-Atg16連接系統(tǒng)一同參與自噬小體的形成，自噬小體形成時(shí)，胞質(zhì)型LC3(LC3-I)會(huì)被切割掉一部分片段，形成膜型LC3(LC3-Ⅱ)[24～28]。SQSTM1/p62可與泛素相互作用，誘導(dǎo)蛋白酶體或溶酶體降解蛋白。自噬中，p62蛋白連接LC3和泛素化底物一同構(gòu)成自噬小體，并且隨著自噬的發(fā)展在自噬溶酶體中與“貨物”一起降解，從而作為自噬降解的可靠指標(biāo)[29]。

因此，本研究采用兩種標(biāo)志物以評估自噬流從生成至降解的過程，即自噬體標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ和自噬降解標(biāo)記蛋白p62。本研究發(fā)現(xiàn)，AMI組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增加，自噬降解指標(biāo)p62蛋白水平降低，提示AMI時(shí)，心肌自噬被激活；DHA預(yù)處理后，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加，p62蛋白水平進(jìn)一步降低，提示DHA在促進(jìn)自噬體生成的同時(shí)，對自噬-溶酶體降解也有作用，對自噬流的通暢可能存在一定程度的作用。在聯(lián)合使用CQ后，阻斷了DHA對自噬流的通暢，于此同時(shí)，DHA對心臟的保護(hù)作用也被逆轉(zhuǎn)，心肌纖維化程度加劇，心臟射血分?jǐn)?shù)降低，血清CK-MB含量回升。以上結(jié)果提示DHA在急性心肌梗死中的心肌保護(hù)作用可被自噬流抑制劑所阻斷，表明DHA可以改善大鼠急性心肌梗死引起的心臟損傷；DHA通過激活心肌自噬而改善AMI引起的心臟損傷。

綜上所述，DHA可通過調(diào)控心肌自噬改善大鼠AMI誘導(dǎo)的心肌損傷并改善其預(yù)后。以自噬為靶標(biāo)研究AMI的診斷及治療，值得臨床重點(diǎn)關(guān)注。