王海宇 謝方瑜 呂 梅 李文利 張巍巍 姜大磊 馬志浩 王曉娟 王鶴鳴 解祥軍

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是一種惡性程度較高的消化道腫瘤，其發(fā)生率及病死率逐年上升，總體5年生存率僅為9%，是目前美國腫瘤相關死亡的第四大原因[1]。手術切除是PC有效的治療方式，僅有15%～20%的患者有條件接受手術切除[2]。糖類抗原19-9(carbohydrate antigen19-9, CA19-9)是目前監(jiān)測PC有效的生物學標志物，其在膽管癌、胃癌、結腸癌等腫瘤中均會升高，在一些膽胰良性疾病中出現(xiàn)假陽性結果，及5%～10%的Lewis陰性表型出現(xiàn)假陰性結果，不推薦作為PC診斷的生物學標志物，因此迫切需要探索有高敏感度和特異性的新型非侵入性生物學標志物用于PC診斷[3～7]。微小RNA(microRNA，miRNA)是長度為17～25個核苷酸的非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以作為腫瘤抑制基因或癌基，有致癌和抑癌功能的miRNA的異常表達與癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關[8, 9]。本研究通過對3個GEO數(shù)據(jù)集進行整合分析，篩選出血清中上調的miRNA(miR-1290)，探討血清miR-1290對PC患者的臨床診斷價值。

資料與方法

1.一般資料：收集2019年9月～2021年11月青島大學附屬青島市市立醫(yī)院收治的35例PC患者(PC組)，患者年齡38～89歲，平均年齡為65±11歲。同期收集23例胰腺良性疾病患者，包括慢性胰腺炎15例、胰腺導管內乳頭狀黏液瘤5例、胰腺神經(jīng)內分泌腫瘤3例，為胰腺良性疾病(benign pancreatic disease controls，DC)組，患者年齡29～80歲，平均年齡為61±12歲。20例健康志愿者為健康對照(healthy controls，HC)組，年齡40～72歲，平均年齡為57±11歲。納入標準：(1)PC組：①臨床確診為PC；②臨床病理資料完整。(2)DC組：①穿刺確診為良性或腹部CT、MRI確診為良性；②未合并其他類型疾??；③臨床病理資料完整。(3)HC組：無肝膽胰疾病史、無其他系統(tǒng)疾病、無惡性疾病。PC組排除標準：①合并有細菌性感染等急性感染性疾?。虎谟袗盒阅[瘤病史；③嚴重的心肌梗死、腦梗死等嚴重疾??；④采血前接受過手術、放化療、免疫治療。本研究經(jīng)青島大學附屬青島市市立醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會審批(倫理學批號：2022臨審字第004號)，患者知情理解并簽署知情同意書。

2.生物信息學篩選差異血清miRNA：為探索PC中差異表達的miRNA，通過GEO數(shù)據(jù)庫獲得PC血清樣本的微陣列數(shù)據(jù)集，對GSE113486、GSE106817和GSE55139數(shù)據(jù)集的PC患者及非癌患者的血清miRNA表達譜進行了綜合分析，篩選出PC患者血清差異表達上調的miRNA，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)測定分析選定的miRNA在本研究樣本中的血清表達情況。

3.標本收集及樣本保存：留取各組清晨空腹外周靜脈血5ml，3500r/min，離心10min，吸取上清液移至EP管中，-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

4.RT-qPCR檢測：取300μl血清，使用TRNzol試劑[天根生化科技(北京)有限公司]從血清中提取總RNA，NanoDrop測定RNA濃度和純度，A260/280為1.8～2.0，應用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(廣州復能基因有限公司，批號：QP013)進行反轉錄形成cDNA，得到cDNA產(chǎn)物后進行RT-qPCR反應，反應混合液由PCR試劑Green Preix Ex Taq Ⅱ(2X)(日本TaKaRa公司，批號：RR820A)配制，放于ABI 7500型熒光定量PCR儀中進行反應，miR-1290的引物序列：上游引物：5′-TGGATTTTTGGATCAGGGA-3′，下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；內參U6：上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，PCR循環(huán)條件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s，共進行40個循環(huán)，每個樣品重復3次。按照2-△△ct計算miR-1290的相對表達量。

5.血清CA19-9水平檢測：試劑購自上海羅氏制藥有限公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定其水平。

6.統(tǒng)計學方法：應用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(Q1，Q3)]表示，組內兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用多因素Logistic回歸分析評價PC發(fā)生的影響因素，受試者操作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線和曲線下面積(area under the curve，AUC)用于評估使用miR-1290及CA19-9作為診斷標志物區(qū)分PC患者與良性胰腺疾病患者和健康個體的診斷價值，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.miR-1290在GRO數(shù)據(jù)集分析中表達上調：本研究對3個GEO數(shù)據(jù)集(GSE113486、GSE106817和GSE59856)進行了PC和非癌患者血清miRNA表達譜的全面比較分析。選取3個數(shù)據(jù)集中前50個表達異常的miRNA，通過WEEN在線數(shù)據(jù)分析取交集后獲得Venn圖，發(fā)現(xiàn)與健康者比較，PC患者血清中只有miR-1290顯著上調，因此，本研究選擇血清miR-1290作為后續(xù)分析的生物學標志物，詳見圖1。

圖1 Venn圖

2.各組血清miR-1290表達水平比較：PC組、DC組和HC組的血清miR-1290表達水平分別為0.51(0.37，0.85)、0.14(0.05，0.28)、0.08(0.04，0.22)，PC組表達水平明顯高于DC組和HC組，差異均有統(tǒng)計學意義(z值分別為-4.554、-4.672，P均<0.05)。

3.血清miR-1290水平與腫瘤臨床病理特征相關性分析：在PC患者樣本中，Ⅲ期和Ⅳ期患者miR-1290表達上調且明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，此外，miR-1246的表達水平與淋巴結轉移、遠處轉移之間存在顯著相關性(P均<0.05，表1)。

表1 胰腺癌患者血清miR-1290水平與腫瘤臨床病理特征相關性分析[M(Q1，Q3)]

4.血清miR-1290、CA19-9及miR-1290聯(lián)合CA19-9檢測胰腺癌的診斷價值：繪制ROC曲線，評估其對PC的診斷能力，血清miR-1290、CA19-9診斷PC的AUC值相似，但miR-1290檢測的敏感度優(yōu)于CA19-9。miR-1290聯(lián)合CA19-9檢測對區(qū)分PC組與HC組的敏感度為85.7%、特異性為87.0%；區(qū)分PC組與HC組的敏感度為91.4%、特異性為85.0%；區(qū)分PC組與所有對照組的敏感度為85.7%、特異性為90.7%。miR-1290聯(lián)合CA19-9檢測在區(qū)分PC組與DC組、PC組與HC組、PC組與所有對照組的AUC分別為0.929(95%CI：0.866～0.992)、0.959(95%CI：0.913～0.996)和0.942(95%CI：0.895～0.989)，聯(lián)合檢測對于PC患者的效能顯著高于單一指標的診斷效能，詳見表2、圖2。

圖2 血清miR-1290、CA19-9診斷胰腺癌的ROC曲線分析A.PC組與DC組；B.PC組與HC組；C.PC組與所有對照組；所有對照組包括DC組和HC組

表2 血清miR-1290、CA19-9診斷胰腺癌的ROC曲線分析

5.PC發(fā)生影響因素的多因素Logistic回歸分析：多因素Logistic回歸分析結果顯示，與DC組比較，吸煙(≥10年，≥10支/天)、飲酒(≥10年，≥25g/d)及血清中miR-1290高表達是影響PC發(fā)生的因素(P均<0.05)；年齡(≥ 60歲)、性別均與PC發(fā)生不相關(P均>0.05，表3)。

表3 胰腺癌發(fā)生影響因素的多因素Logistic回歸分析

討 論

PC是世界上較為致命的疾病之一，發(fā)生率逐年持續(xù)升高，PC起病隱匿、惡性程度高、病情進展快，大多數(shù)患者確診時已處于晚期，失去手術機會，預后極差，早期手術治療可明顯改善預后[10]。目前影像學檢查和病理學檢測是PC的主要診斷手段，但影像學檢查無法早期檢測病情，胰腺穿刺活檢是診斷PC的金標準，但胰腺穿刺活檢是一種侵襲性操作，臨床應用有一定的局限性[11]。因此，迫切需要探索有高敏感度和特異性的新型非侵入性生物學標志物用于PC診斷，為患者提供手術機會，改善預后。CA19-9診斷PC的敏感度及特異性較低，不適合用于PC篩查診斷。研究表明，miRNA可以作為腫瘤抑制基因或癌基因，是癌癥診斷和治療的潛在靶點。此外，其有高度保守性、組織特異性及在體液中良好的穩(wěn)定性，使得通過miRNA檢測分析有可能成為疾病檢測的手段[9]。研究顯示，腫瘤特異性miRNA聯(lián)合血清CA19-9的生物學標志物可用于PC診斷[12]。CA19-9與miRNA生物學標志物的聯(lián)合檢測比單個CA19-9檢測可以提高診斷的準確度[12]。

研究表明，miRNA在PC中差異表達，由于研究分析之間的miRNA譜可能存在不一致性，本研究對3個GEO數(shù)據(jù)集進行了整合分析，發(fā)現(xiàn)血清miR-1290在PC患者中顯著上調。文獻報道，miR-1290在肺癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌等腫瘤組織中呈高表達，在PC組織及細胞系中表達亦上調，且在培養(yǎng)的腫瘤細胞系中的上清miR-1290的表達水平隨著細胞密度和培養(yǎng)時間的增加而增加[13～17]。因此推斷miR-1290可作為新生物學標志物預測并篩查PC[18]。既往研究表明，在PC組織miRNA的差異表達研究中，Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性浸潤性胰腺導管腺癌細胞中的miR-1290高于正常胰腺導管，表明血清miR-1290表達來源于PC組織細胞。為了進一步評估血清miR-1290水平升高的來源，Li等[19]通過定量分析胰腺miR-1290的表達，證實原發(fā)性PC細胞中miR-1290表達升高，且高于正常胰腺導管組織。另有研究表明，在PC腫瘤切除后，血清miR-1290表達水平較術前明顯降低[20]。在胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)中，核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)在大部分PC患者中被激活，通過IκB激酶復合物1(I-kappa B kinase complex, IKK1)與KRAS的突變相關聯(lián)。Ta等[21]的細胞研究表明，miR-1290作為癌基因發(fā)揮作用，可能通過直接靶向IKK1的3′-非翻譯區(qū)成為癌基因，IKK1沉默增強了PC細胞的增殖、侵襲能力。研究證明，miR-1290可以通過抑制FOXA1/2的表達，從而促進PDAC的惡性進展，F(xiàn)OXA1/2參與上皮間質轉化[22]。與此同時，陳自力等[17]研究表明，通過使用miRNA-1290抑制劑處理PC細胞，抑制PC細胞的侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶2及環(huán)氧化酶2的表達，減弱了PC細胞的侵襲及轉移。上述研究表明，miR-1290參與了PC發(fā)生、發(fā)展過程中的廣泛生理和病理過程。所以本研究篩選出血清中上調的miR-1290，探討血清miR-1290及聯(lián)合CA19-9對PC診斷的臨床價值。

本研究結果顯示，PC組中血清miR-1290表達水平與DC組及HC組比較顯著上調，與既往研究結果相一致，可作為PC診斷的血清生物學標志物。多因素Logistic回歸分析結果顯示，血清miR-1290相對高表達是影響PC發(fā)生的危險因素，且本研究中PC臨床病理資料分析顯示，miR-1290升高與腫瘤T分期、淋巴結轉移、遠處轉移相關，提示血清miR-1290可能與PC的侵襲、轉移密切相關?；诒狙芯浚肦OC曲線評估m(xù)iR-1290、miR-1290聯(lián)合CA19-9檢測對PC的診斷價值，結果表明，miR-1290對診斷PC的AUC值及敏感度均優(yōu)于CA19-9，特異性與CA19-9相似，提示miR-1290可作為CA19-9的補償性循環(huán)腫瘤標志物診斷PC。miR-1290聯(lián)合CA19-9檢測PC的AUC值明顯優(yōu)于單一的miR-1290、CA19-9檢測，敏感度高于任一單一指標檢測，提示miR-1290、CA19-9聯(lián)合檢測對診斷PC有較高的臨床應用價值。

綜上所述，miR-1290在PC患者血清中表達水平顯著升高，聯(lián)合檢測miR-1290、CA19-9能提高診斷PC的準確性，診斷效能高于任一單一指標。血清中miRNA提取方便且易檢測，因此，miR-1290可能作為PC診斷的循環(huán)腫瘤生物學標志物，但本研究存在一些局限性，如樣本量相對較小，miR-1290的表達水平在PC組織樣本中未得到驗證，今后需要擴大樣本量進一步驗證，并驗證PC組織中其表達量。