林海敏 黨勝春 郄吟吟 胡 蓉

胰腺癌的發(fā)生率和病死率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[1]。胰腺癌患者中90%的病理類型是胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)，胰腺癌患者可手術(shù)率只有20%，5年生存率低于5%，1年生存率約17%，目前在成人腫瘤中仍是預(yù)后最差的一種[2～4]。

從20世紀(jì)90年代起陸續(xù)建立了各種腫瘤細(xì)胞體外藥敏模型，包括細(xì)胞株移植瘤模型(cell-line-derived xenograft，CDX)及人源腫瘤異種移植(patient derived tumor xenograft，PDTX)模型等用于腫瘤個(gè)體化治療藥效學(xué)檢測?！兑认侔┚C合診治指南(2018版)》提出，PDTX模型在胰腺癌中的應(yīng)用為胰腺癌個(gè)體化診療提供思路[5]。PDTX很好地保留了患者原始腫瘤的基本特征、瘤內(nèi)微環(huán)境、組織病理、遺傳及表型方面的特征，因而能較好地預(yù)測藥物的反應(yīng)性[6～9]。

G蛋白信號調(diào)控因子2(G-protein signaling modulator 2，GPSM2)屬于GPCR家族。最初發(fā)現(xiàn)GPSM2在維持細(xì)胞紡錘體的正確定位、確保細(xì)胞對稱性分裂、參與細(xì)胞分裂的G2/M期調(diào)控發(fā)揮著重要作用[10～13]。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究表明，GPSM2在胰腺癌組織中過表達(dá)，且其表達(dá)程度與胰腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移、腫瘤分化類型及預(yù)后有一定相關(guān)性[14]。本研究在設(shè)計(jì)PDTX模型驗(yàn)證模型可行性的同時(shí)，亦旨在驗(yàn)證以GPSM2作為目標(biāo)靶的藥物是否能夠抑制PDTX模型胰腺癌細(xì)胞、組織的生長。

材料與方法

1.材料：Trizol試劑、MTT購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。蛋白酶抑制劑及BCA法蛋白含量檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。羊抗兔IgG+HRP、羊抗鼠IgG +HRP 購自美國Jackson公司。兔抗-ki-67(ab16667)、兔抗-PCNA(ab92552)購自英國Abcam公司。RPMI 1640培養(yǎng)基及FBS夠自美國Gibco公司。羊抗兔IgG+HRP購自常州中美歆新生物科技有限公司，SYBGRE PCR MasterMix購自美國Invitrogen公司，sh-GPSM2慢病毒包裝購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司，Tween-20購自中國BBI生命科學(xué)有限公司，BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自加拿大Fermentas公司，PVDF膜購自美國Bio-Rad公司。5例胰腺癌組織樣本取自2019年1月～2020年12月入選標(biāo)準(zhǔn)為中國臨床腫瘤學(xué)會胰腺癌診療指南手術(shù)實(shí)施R0切除的患者，胰腺癌分期類型參照UICC/AJCC TNM 2017分期系統(tǒng)[5，15]。

2.胰腺癌PDTX模型的建立：選取4～6周齡體質(zhì)量30g左右的裸鼠于SPF級屏障環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)3天以上適應(yīng)基本環(huán)境[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SYXK(蘇)2013-0036]。從手術(shù)中獲取入組患者腫瘤標(biāo)本組織后，迅速保存在低溫的RPMI 1640培養(yǎng)基(其中含20%胎牛血清和0.05%鏈霉素)中，并盡快移植到小鼠體內(nèi)。移植前剔除腫瘤標(biāo)本中壞死、破碎的組織，將品相良好組織分割為約2mm×2mm×3mm大小，麻醉小鼠后，將處理好的腫瘤塊移植到小鼠皮下及腎囊膜，縫合切口。將剩余的組織進(jìn)行石蠟塊包埋。待移植瘤長到合適大小后，進(jìn)行取瘤、移植傳代。脫臼法處死荷瘤鼠后，將小鼠置于75%乙醇中浸泡2min，手術(shù)獲取腫瘤組織后，接種方法如上所述。重復(fù)上述步驟，至第3代后，待瘤體長至100～200mm3適時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，使用3～7代進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)。

3.動(dòng)物體內(nèi)藥物敏感度測試：使用第3～7代的體質(zhì)量約為30g胰腺癌PDTX模型小鼠進(jìn)行療效評價(jià)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)荷瘤小鼠瘤體體積為100～200mm3時(shí)，將小鼠使用隨機(jī)區(qū)組法隨機(jī)分為對照組、sh-GPSM2組(sh-GPSM2慢病毒，50mg/kg)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)化療組(20mg/kg)，每組各5只，瘤內(nèi)給藥，每次溶劑劑量為1.5ml，每3天1次，治療2周。藥物干預(yù)2周之后，評估給藥組與對照組的相對腫瘤抑制率(tumor growth inhibition，TGI)，計(jì)算方法為：TGI=1-T/C，T/C代表給藥組的瘤體體積/對照組的瘤體體積。小鼠的體質(zhì)量、體積每3天測量1次，小鼠腫瘤體積每3天測量1次。體積計(jì)算方法為：腫瘤體積(V)=(長徑×短徑2)/2。

4.RT-qPCR檢測：使用Trizol試劑從對照組、sh-GPSM2組藥物干預(yù)18天后的新鮮荷瘤中提取總RNA，分離提取mRNA后，采用三步法進(jìn)行RT-qPCR，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列詳見表1。采用相對定量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，采用RQ=2-△△CT法計(jì)算GPSM2的相對表達(dá)量。

表1 RT-qPCR所使用的引物序列

5.Western blot法檢測：分別取對照組、sh-GPSM2組化療18天后的新鮮荷瘤各5個(gè)，剪碎，取適量組織加入500μl的基礎(chǔ)裂解液30min裂解，在冰上離心后取上清，紫外分光光度計(jì)測定細(xì)胞裂解液蛋白濃度，加入上樣緩沖液，煮沸制備蛋白樣品，-80℃冰箱保存。配置好電泳膠后上樣蛋白樣品緩沖液混合液、70V電壓電泳、100V冰水混合浴中轉(zhuǎn)膜、洗膜后一抗4℃孵育12h、TBST(即TBS+Tween)漂洗3次5min洗膜、二抗常溫孵育12h后同樣洗膜3次，通過ECL Reagent顯影后掃膜，使用Image J軟件測量灰度值，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

6.流式細(xì)胞術(shù)檢測：①胰酶消化細(xì)胞，離心后去上清，使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)清洗；5×105個(gè)細(xì)胞量的懸液離心去上清，加入100μl的緩沖液中重懸；加入Annexin V和7-AAD各5μl，室溫避光孵育15min；加入400μl的結(jié)合緩沖液，低溫避光保存，1h內(nèi)上機(jī)檢測；②將單細(xì)胞懸液2ml離心，棄上清；加入PBS洗滌、離心，再次棄上清；4℃下70%乙醇固定30min后離心，棄上清；PBS洗滌，再次離心；于500μl PBS中加入RNase A，37℃孵育30min，離心；用PBS洗滌，離心后加入PI于500μl PBS中，室溫避光孵育30min后進(jìn)行檢測。

結(jié) 果

1.PDTX模型及腫瘤體積、重量變化：PDTX模型成功建立(圖1A)，sh-GPSM2組抑癌率為66.61%，5-FU化療組的抑癌率為72.76%(圖1B)。3組干預(yù)6天后，每3天再評估，發(fā)現(xiàn)sh-GPSM2組、5-FU化療組腫瘤生長受抑制。5-FU、sh-GPSM2組干預(yù)后，模型腫瘤體積明顯縮小(P<0.001)。小鼠體內(nèi)腫瘤組織對sh-GPSM2制劑、5-FU反應(yīng)性良好，且抑制腫瘤作用比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C)。在sh-GPSM2、5-FU化療組與對照組間，實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤瘤體的重量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖1D)。

圖1 小鼠模型、瘤體與參數(shù)A.小鼠胰腺癌PDTX模型；B.藥物干預(yù)后18天后各組瘤體組織標(biāo)本；C.藥物干預(yù)不同天數(shù)各組平均腫瘤體積；D.藥物干預(yù)18天后各組平均腫瘤重量。與對照組比較，*P<0.001

2.RT-qPCR檢測應(yīng)用sh-GPSM2制劑對GPSM2基因表達(dá)的影響：使用了sh-GPSM2制劑的實(shí)驗(yàn)組較對照組中的胰腺癌腫瘤細(xì)胞GPSM2基因表達(dá)水平明顯下降(P<0.001，圖2)。

圖2 對照組及sh-GPSM2組的GPSM2相對表達(dá)水平

3.Western blot法檢測腫瘤組織中周期相關(guān)蛋白ki-67、PNCA表達(dá)水平：sh-GPSM2組、5-FU化療組與對照組比較，與對照組間ki-67、PNCA表達(dá)，sh-GPSM2、5-FU化療組的ki-67、PNCA的表達(dá)被抑制(P<0.05，圖3)。

圖3 Western blot法檢測周期蛋白表達(dá)對比A.使用Western blot法檢測不同分組腫瘤周期相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；B.各組目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測PDTX腫瘤細(xì)胞凋亡和周期：5-FU化療組、sh-GPSM2組在S期的細(xì)胞百分比明顯升高，說明sh-GPSM2制劑能抑制細(xì)胞周期于S期(P<0.01，圖4中A、B)；對照組腫瘤細(xì)胞早期凋亡較少，5-FU化療組、sh-GPSM2組腫瘤細(xì)胞早期凋亡比例增加(P<0.01，圖4中A、C)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡與周期及統(tǒng)計(jì)分析A.流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞凋亡和周期；B.各組早期凋亡細(xì)胞百分比；C.各組停留于S期細(xì)胞百分比

討 論

PDTX能夠在同一時(shí)間內(nèi)對多只鼠移植同一來源的腫瘤組織并保持腫瘤特征，也可以通過獲取不同發(fā)展階段的腫瘤建立對應(yīng)階段的腫瘤模型，進(jìn)行不同時(shí)期腫瘤細(xì)胞、分子改變所導(dǎo)致的腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)機(jī)制和耐藥性機(jī)制的研究[16]。PDTX能客觀模仿患者原發(fā)腫瘤，能夠比較好地還原患者原發(fā)病灶的微生態(tài)環(huán)境、腫瘤性質(zhì)等，因此可針對特定的腫瘤篩選最合適、有效的抗腫瘤藥物[17]。

國內(nèi)外多篇文獻(xiàn)報(bào)道，GPSM2與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系緊密，包括肝癌、肺癌、乳腺癌[18～21]。筆者團(tuán)隊(duì)前期的研究表明，GPSM2高表達(dá)的胰腺癌預(yù)后較差。本研究在建立模型的同時(shí)，利用在體胰腺癌動(dòng)物PDTX模型，以GPSM2為切入點(diǎn)，驗(yàn)證GPSM2作為治療靶標(biāo)的可行性，sh-GPSM2制劑的實(shí)用性及抗耐藥性值得期待。

本研究中RT-qPCR檢測結(jié)果說明sh-GPSM2制劑能夠抑制GPSM2的表達(dá)水平，類似靶向藥物抑制PDTX模型個(gè)體腫瘤的生長，這與PDTX模型腫瘤對sh-GPSM2反應(yīng)效果有相關(guān)性，sh-GPSM2制劑能夠使PDTX模型胰腺癌腫瘤體積縮小、重量下降，抑制PDTX模型個(gè)體腫瘤的生長。而對照組腫瘤體積增大更快、腫瘤增重更快，對照組的周期相關(guān)蛋白ki-67、PNCA表達(dá)都較sh-GPSM2組高，sh-GPSM2制劑與5-FU能夠抑制周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。sh-GPSM2組的腫瘤細(xì)胞停留于S期細(xì)胞比例增多，且早期凋亡細(xì)胞比例增多，推斷這兩種藥物干預(yù)均能夠?qū)DTX胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期有抑制作用，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞早期凋亡。驗(yàn)證了GPSM2能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，參與細(xì)胞周期調(diào)控，GPSM2在參與細(xì)胞分裂的G2/M期發(fā)揮了重要的功能。

本研究建立了胰腺癌患者病理來源的PDTX模型，使用藥物治療后，可反映治療藥物對胰腺癌腫瘤的影響，通過分析PDTX模型裸鼠的腫瘤生長速度、體積、周期相關(guān)基因及蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡等情況，對治療藥物的有效性做出判斷。使用sh-GPSM2制劑靶向治療可顯著抑制PDTX模型中胰腺癌細(xì)胞的生長，sh-GPSM2制劑可能作為一種新型胰腺癌靶向化療藥物等待開發(fā)，但是其具體的不良反應(yīng)需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。另外，后期研究中，共同應(yīng)用sh-GPSM2制劑與5-FU、胰腺癌靶向治療藥物、常規(guī)化療藥物如吉西他濱等進(jìn)行研究，檢測它們是否有協(xié)同作用，以獲得更好的胰腺癌治療方案，在低劑量藥物治療、更少的不良反應(yīng)同時(shí)獲得更好的療效。在將來臨床應(yīng)用過程中，本實(shí)驗(yàn)?zāi)苤笇?dǎo)胰腺癌患者在需要化學(xué)干預(yù)早期就篩選出有效性、安全性最佳的治療方案。

綜上所述，胰腺癌模型中的GPSM2高表達(dá)者增長速度較快，抑制GPSM2的表達(dá)可以抑制PDTX模型腫瘤的生長。故而可以在病患確診胰腺癌早期，使用PDTX模型篩選、驗(yàn)證sh-GPSM2制劑這種藥物的有效性，通過對PDTX模型治療后反應(yīng)的監(jiān)測，以及對模型中細(xì)胞的一系列增殖情況的研究，獲得的結(jié)果能指導(dǎo)建立sh-GPSM2制劑敏感的胰腺癌患者的個(gè)體化診療方案。