夏新宇 李 磊 王少康 許碩貴 王美堂

熱射病(heat stroke, HS)是重癥中暑中最為嚴(yán)重的一種分型，以核心體溫>40.0±0.5℃，中樞系統(tǒng)病變 (如譫妄、驚厥、昏迷等)，系統(tǒng)性炎癥及多臟器損害為特征[1]。即使該類患者給予積極治療后，仍有75%病患發(fā)展至多臟器衰竭[2]。肝損傷在HS中常見，通常損傷較輕，但是在治療過程中有可能發(fā)展成為急性肝衰竭，導(dǎo)致患者的死亡[3, 4]。

乳鐵蛋白(lactoferrin, LF)是一種80kDa的低分子鐵結(jié)合糖蛋白，廣泛存在于哺乳動物組織和體液內(nèi)，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化等作用[5]。不同物種之間的LF具有高度同源性[6, 7]。本研究聚焦口服牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin, BLF)對HS大鼠肝損傷的改善情況，以期找到一種減輕HS危害的防治方法。

材料與方法

1.動物和材料：64只成年雄性Sprague-Daw大鼠(7～8周齡，體質(zhì)量為250～300g)購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2008-0016]。購得大鼠飼養(yǎng)于中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)無特定病原體級動物實驗中心，每籠6只，室內(nèi)溫度為22±1℃，相對濕度為50%±5%，保持12h白天/12h黑夜晝夜節(jié)律。BLF購自湖北威德利化學(xué)科技有限公司(CAS編號：112163-33-4，500克/袋，純度：98%)。本研究通過中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)動物倫理學(xué)委員會審批(倫理審批號：SMMU—2017324)。

2.分組和干預(yù)：64只大鼠按照完全隨機化分組方式分成 4組，即對照組(n=16)、熱射病組(HS組，n=16)、低劑量干預(yù)組(LBLF組，n=16)和高劑量干預(yù)組(HBLF組，n=16)。對照組及HS組大鼠以磷酸鹽緩沖液10ml/kg灌胃1周，LBLF及HBLF組分別以100、200mg/kg BLF灌胃1周。

3.HS造模：本研究采用恒溫恒濕箱將造模環(huán)境溫度穩(wěn)定在40.0±0.5℃，相對濕度穩(wěn)定在60%±5%。在腹腔植入測溫膠囊監(jiān)測大鼠核心體溫的變化，造模和監(jiān)測方法同前[8]。以大鼠核心體溫到達42℃為HS發(fā)病的標(biāo)準(zhǔn)[9]。對照組置于25.0±0.5℃，濕度50%±5%環(huán)境中1h，禁食禁水。

4.樣本收集：造模開始至造模后3h內(nèi)，若存活大鼠少于每組最低要求(n=8)，補充實驗達到數(shù)量要求。最終每組各8只，共32只大鼠用于樣本的收集。造模后3h，以異氟烷氣道麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈采集血液樣本，4℃下，以3000r/min離心10min，收集上清液于-80℃冰箱凍存待測。獲取血清樣本后，打開大鼠腹腔，充分暴露肝臟獲取部分肝臟組織，立即浸泡于4%多聚甲醛溶液，以既往使用方法處理后分析病理情況[8]。再次獲取肝臟組織，吸水紙吸干表面液體，凍存于-80℃冰箱凍存，根據(jù)需要取對應(yīng)重量制備肝臟組織勻漿測定丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量，超氧化物岐化酶(superoxydismutase, SOD)活性。

5.指標(biāo)測定：(1)血清生化數(shù)據(jù)的測定：用全自動生化分析儀(日立7080，日本日立公司)測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平。(2)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)水平和SOD的測定：用MDA試劑盒(貨號：A003-1，南京建成生物工程研究所)測定肝臟勻漿中MDA濃度反應(yīng)脂質(zhì)過氧化水平。用SOD試劑盒(貨號：A001-3，南京建成生物工程研究所)測定肝臟組織勻漿中SOD活力。方法參照Deng等[10]的研究。(3)肝臟病理評分：隨機選取每張肝臟切片的8個區(qū)域在200倍光鏡下參照Zhou等[11]的研究進行病理評分。

結(jié) 果

1.核心體溫變化：與HS組(57.75±4.71min)比較，LBLF組(71.00±5.29min)、HBLF組(90.88±3.56min)核心體溫到達HS發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)(42℃)的平均時間均顯著延長(P<0.001)。

2.血清生化指標(biāo)的變化：在HS發(fā)生3h后，HS組血清ALT、AST、LDH均較對照組顯著升高。與HS組比較，LBLF組稍有改善，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而HBLF組顯著改善了這3項指標(biāo)水平(P<0.05，表1)。

表1 4組大鼠血清生化指標(biāo)水平變化

3.肝臟組織勻漿脂質(zhì)過氧化水平和SOD活性變化：HS組MDA含量較對照組顯著升高，但是SOD活力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。LBLF組對于SOD活性以及MDA含量影響比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，HBLF組和HS組比較，SOD活性顯著提高，同時MDA含量也顯著下降(表2)。

表2 4組大鼠SOD活性和MDA含量變化

4.肝臟病理評分改變：HS組肝臟病理切片可見肝細胞大量壞死，細胞核深染，嗜酸性粒細胞增多，細胞質(zhì)呈圓形空泡，局部膽管周圍粒細胞浸潤。LBLF組中，肝臟病理破壞好轉(zhuǎn)，HBLF組進一步改善(圖1)。LBLF組、HBLF組均較HS組病理評分顯著下降(5.95±0.44、3.00±0.49、8.22±0.31分，P<0.001)。

圖1 4組大鼠肝臟病理切片變化(HE染色，×200)A.對照組肝臟病理切片：肝細胞索間界清晰，細胞質(zhì)界線明顯，細胞質(zhì)內(nèi)偶有小空泡；B.熱射病組肝臟病理切片：肝細胞腫脹明顯，索間界模糊，肝細胞細胞核染色加深，細胞質(zhì)內(nèi)空泡顯著增多，細胞周圍炎性細胞浸潤及充血；C.LBLF組肝臟病理切片：肝細胞索間界較清晰，細胞質(zhì)內(nèi)空泡減少，細胞周圍炎癥及充血減輕；D.HBLF組肝臟病理切片，肝細胞索間界清晰，肝細胞無腫脹，炎性細胞減少，充血顯著減輕。黑色箭頭所示為肝細胞腫脹壞死；綠色箭頭所示為細胞質(zhì)空泡；藍色箭頭所示為炎性細胞浸潤；紅色箭頭所示為充血

討 論

據(jù)統(tǒng)計，HS的發(fā)生率有逐年升高的趨勢，即使救治得當(dāng)，仍有較高的病死率[12]。因此，尋求有效措施預(yù)防HS的發(fā)生顯得尤為重要。肝臟作為機體的重要解毒器官，在HS的病程中常受到損害[13]。早期保護肝功能，可以更有效地維持機體免疫調(diào)節(jié)能力。嚴(yán)重的肝損害是HS臟器損害的一個重要特征，高熱、低血壓、臟器血流再分配都是引起肝損害的原因[14]。高熱具有細胞毒性，往往在早期引起肝臟的損傷[3]。LF具有抑制促炎性細胞因子、促進抗炎性細胞因子產(chǎn)生的作用[15]。目前尚無研究探索預(yù)口服LF對于HS肝損害的保護作用。本研究通過給予SD大鼠預(yù)口服高低劑量的BLF后建立HS模型，通過分析大鼠造模時達到目標(biāo)體溫時間、血清生化水平、肝臟組織勻漿SOD活力、MDA含量及病理評分等相關(guān)因素的變化，評估BLF對于HS大鼠肝臟的保護作用。在給予BLF預(yù)口服后，大鼠核心溫度達到HS標(biāo)準(zhǔn)的時間明顯延長，而且隨著口服BLF濃度的增高進一步延長?？梢缘贸鼋Y(jié)論，高、低劑量BLF均可以有效提高大鼠的熱耐力。

肝細胞破壞時，ALT、AST、LDH大量釋放入血，其升高程度和肝細胞破壞呈正相關(guān)，過度的肝細胞破壞會導(dǎo)致肝功能進一步受損。LBLF組、HBLF組的生化指標(biāo)顯著下降提示BLF可以使得HS大鼠肝細胞破壞減少，盡可能在HS早期保留肝臟功能。LF可以通過核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)和MAP激酶這兩條信號通路，在細胞水平上調(diào)節(jié)細胞免疫[15]。HS發(fā)生后，腸源性內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致內(nèi)毒素進入體循環(huán)加重機體的炎癥損傷[16, 17]。Geng等[4]研究發(fā)現(xiàn)，HS激活了肝臟中的炎性小體，活化的炎性小體誘導(dǎo)肝細胞凋亡，加重肝臟損傷。綜上所述，LF可能通過其抗炎作用，緩解肝臟損傷。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終末產(chǎn)物，通過測定其水平高低可以反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)嚴(yán)重程度[18]。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可以抑制HS大鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)改善肝損害。本研究結(jié)果顯示，HS組大鼠肝臟組織勻漿中MDA濃度的顯著提高。LF可以通過清除一氧化氮和1，1 -二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基而發(fā)揮抗氧化活性[20]?？诜﨤F可以顯著提高SOD的活性[21]。

綜上所述，給予BLF預(yù)口服的大鼠在HS發(fā)生后肝臟組織勻漿SOD顯著升高，MDA含量下降，提示脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的減輕。預(yù)口服BLF可以有效改善HS大鼠肝臟的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)水平，改善病理損傷，提高大鼠熱耐力，提示口服BLF可能是防治HS的一種有效措施。本課題組擬設(shè)計更多實驗進一步探討B(tài)LF在HS肝臟損傷中的保護機制。