羅全慧 尹 恒 黃 柯 王錦星 趙 琳

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病因素包括基因突變、病毒感染等[1]。宮頸癌發(fā)生率和病死率均較高，尤其宮頸癌中晚期和復(fù)發(fā)患者的預(yù)后很差，與宮頸癌細(xì)胞的惡性增殖和侵襲關(guān)系密切[2]。因此，探究宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲的分子機(jī)制對宮頸癌臨床治療有重要意義。微小RNA(microRNA, miRNA)主要在基因的轉(zhuǎn)錄水平參與調(diào)控靶基因的表達(dá)，其表達(dá)失衡可引起靶基因的轉(zhuǎn)錄改變，影響細(xì)胞分化、代謝、發(fā)育、增殖、侵襲等各種細(xì)胞活動[3]。miRNA是介導(dǎo)惡性腫瘤包括宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的重要因素，以miRNA為靶點(diǎn)的新型治療策略是宮頸癌臨床治療研究的熱點(diǎn)[4, 5]。miR-3074是新明確的miRNA家族成員，已被證實(shí)參與三陰性乳腺癌的進(jìn)展，在其中發(fā)揮抑癌基因的作用[6]。miR-3074對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響并不清楚。本研究旨在分析miR-3074在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，探討miR-3074對宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及其分子作用機(jī)制，為宮頸癌的miRNA靶向治療提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.細(xì)胞與試劑：正常宮頸上皮細(xì)胞H8、宮頸癌細(xì)胞(SiHa、HCC94、C33A、HeLa)購自美國典型培養(yǎng)物菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司。Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。熒光實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)相關(guān)試劑盒購自日本TaKaRa公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Amresco公司。Transwell小室購自美國Corning公司。對照模擬物、miR-3074模擬物、EPS8mRNA野生型載體、EPS8mRNA突變型載體、si-NC和si-EPS8購自上海吉瑪生物制藥技術(shù)有限公司。CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司。一抗皮生長因子受體通路底物8(epidermal growth factor receptor substrate 8，EPS8)、β-tubulin、Claudin-1、ZO-1和Twist及二抗均購自美國CST公司。

2.生物信息學(xué)分析miR-3074表達(dá)與宮頸癌患者總生存期的相關(guān)性：應(yīng)用OncoLnc在線數(shù)據(jù)庫分析miR-3074表達(dá)水平與宮頸癌患者總生存期的關(guān)系。

3.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：常規(guī)復(fù)蘇C33A、H8細(xì)胞，采用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，常規(guī)復(fù)蘇SiHa、HCC94、HeLa細(xì)胞，采用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期HCC94細(xì)胞接種至6孔板，依據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別轉(zhuǎn)染對照模擬物和miR-3074模擬物至HCC94細(xì)胞，即對照組和miR-3074組；分別轉(zhuǎn)染si-NC和si-EPS8至HCC94細(xì)胞，即si-NC組和si-EPS8組。轉(zhuǎn)染結(jié)束后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4.RT-qPCR檢測：按照TRIzol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行RT-qPCR檢測。反應(yīng)體系為30μl，反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性4min；95℃變性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共33次循環(huán)。引物序列如下，miR-3074上游引物：5′-CCTCAAGGCTGTGTTGTCAAG-3′，下游引物：5′-ATACCACTGCTGTTGGGTCTG-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；EPS8上游引物：5′-TGAATGGCTACGGATCATCACC-3′，下游引物：5′-CACTGTCCCGTGCATAATTCT-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。以U6為內(nèi)參，確定miR-3074相對表達(dá)量；以GAPDH為內(nèi)參，確定EPS8mRNA相對表達(dá)量，采用2-ΔΔCt公式計算miR-3074和EPS8mRNA的相對表達(dá)量。

5.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)：運(yùn)用生物信息學(xué)軟件RNAhybrid預(yù)測miR-3074的靶基因?yàn)镋PS8。收集對數(shù)生長期的HCC94細(xì)胞，將EPS8mRNA野生型載體、EPS8mRNA突變型載體與對照模擬物或miR-3074模擬物共轉(zhuǎn)染至HCC94細(xì)胞，依照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染。在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定相對熒光素酶活性。

6.Western blot法實(shí)驗(yàn)：收集轉(zhuǎn)染的HCC94細(xì)胞，提取總蛋白后測定蛋白濃度，每組取適量蛋白行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠電泳，采用聚偏氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，于4%封閉液中進(jìn)行封閉。依次加入一抗EPS8(1∶1000稀釋)、β-tubulin(1∶1000稀釋)、Claudin-1(1∶1000稀釋)、ZO-1(1∶1000)、Twist(1∶1000)，4℃下孵育8h。加入二抗(1∶5000)孵育。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測每組蛋白表達(dá)，在凝膠成像系統(tǒng)中顯色、拍照。

7.CCK-8法檢測HCC94細(xì)胞增殖活力：收集轉(zhuǎn)染的HCC94細(xì)胞，以3×103個/孔細(xì)胞接種至96孔板，分別于培養(yǎng)第1、2、3、4、5天時，每孔加入濃度為6mg/ml的CCK-8溶液10μl，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，運(yùn)用全自動酶標(biāo)儀測定450nm波長處每孔的吸光度A值，繪制HCC94細(xì)胞生長曲線。

8.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測HCC94細(xì)胞侵襲能力：在冰上采用培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠，均勻滴加至Transwell小室，消除氣泡，培養(yǎng)箱內(nèi)靜置1h。收集轉(zhuǎn)染的HCC94細(xì)胞，采用不含血清的培養(yǎng)基重懸，以3×104個/孔細(xì)胞接種至Transwell小室上室，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基至下室。在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用甲醇固定上室，用0.2%結(jié)晶紫染色上室，棉簽擦去未侵襲的細(xì)胞，于100倍倒置顯微鏡下拍照觀察，計數(shù)發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)。

結(jié) 果

1.miR-3074與宮頸癌患者總生存期的關(guān)系：OncoLnc在線數(shù)據(jù)庫顯示(圖1)，miR-3074表達(dá)水平較高的宮頸癌患者總生存期長于miR-3074表達(dá)水平較低的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

圖1 miR-3074與宮頸癌患者總生存期的關(guān)系

2.miR-3074在宮頸癌細(xì)胞系中低表達(dá)： RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，miR-3074在宮頸癌細(xì)胞(SiHa、HCC94、C33A、HeLa)及正常宮頸上皮細(xì)胞H8的表達(dá)分別為0.70±0.02、0.23±0.03、0.48±0.06、0.59±0.07和1.06±0.12。與H8細(xì)胞比較，宮頸癌細(xì)胞系中miR-3074表達(dá)降低(t=2.925，P=0.027；t=6.930，P<0.001；t=4.404，P=0.005；t=3.379，P=0.015)，其中miR-3074表達(dá)最低的細(xì)胞系是HCC94(F=13.400，P<0.001，圖2)。

圖2 miR-3074在宮頸癌細(xì)胞系(SiHa、HCC94、C33A、HeLa)和正常宮頸上皮細(xì)胞(H8)中的表達(dá)與H8細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.轉(zhuǎn)染miR-3074模擬物促進(jìn)HCC94細(xì)胞中miR-3074表達(dá)：miR-3074組和對照組HCC94細(xì)胞中miR-3074表達(dá)分別為13.49±2.66和1.03±0.17，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.680，P=0.003)。

4.生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-3074的靶基因：生物信息學(xué)軟件RNAhybrid預(yù)測顯示，miR-3074與EPS8 3′非翻譯區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)和突變位點(diǎn)詳見圖3。

圖3 生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-3074的靶基因

5.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-3074對EPS8的靶向作用：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，對照模擬物、EPS8mRNA野生型共轉(zhuǎn)染組與miR-3074模擬物、EPS8mRNA野生型共轉(zhuǎn)染組相對熒光酶活性分別是1.03±0.09和0.26±0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.336，P<0.001)；對照模擬物、EPS8mRNA突變型共轉(zhuǎn)染組與miR-3074模擬物、EPS8mRNA突變型共轉(zhuǎn)染組相對熒光酶活性分別是1.08±0.13和1.01±0.07，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.407，P=0.698)，提示miR-3074可靶向結(jié)合EPS8 mRNA(圖4)。

圖4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-3074對EPS8的靶向作用

6.上調(diào)miR-3074對EPS8mRNA表達(dá)的影響：RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與H8細(xì)胞比較，宮頸癌細(xì)胞系中EPS8mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.001)，其中miR-3074表達(dá)最低的細(xì)胞系是HCC94(F=39.970，P<0.001)。miR-3074組和對照組HCC94細(xì)胞中EPS8mRNA表達(dá)分別為1.23±0.12和6.83±0.91，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.583，P=0.004)，表明高表達(dá)miR-3074可靶向抑制EPS8mRNA的表達(dá)(圖5)。

圖5 EPS8mRNA在宮頸癌細(xì)胞系(SiHa、HCC94、C33A、HeLa)和正常宮頸上皮細(xì)胞(H8)中的表達(dá)與H8細(xì)胞比較，*P<0.01

7.上調(diào)miR-3074對EPS8蛋白表達(dá)的影響：Western blot法檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-3074模擬物后，EPS8蛋白表達(dá)降低，上皮細(xì)胞表型蛋白ZO-1和Claudin-1表達(dá)增加，間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白Twist表達(dá)降低(圖6)。

圖6 高表達(dá)miR-3074對HCC94細(xì)胞EPS8蛋白表達(dá)的影響

8.干擾EPS8對HCC94細(xì)胞增殖活力的影響：CCK-8法檢測結(jié)果顯示，在第2、3、4、5天，si-EPS8組HCC94細(xì)胞D值低于si-NC組(P<0.05)，表明干擾EPS8可抑制HCC94細(xì)胞的增殖活力(表1)。

表1 CCK-8法檢測干擾EPS8對HCC94細(xì)胞增殖活力的影響

9.干擾EPS8對HCC94細(xì)胞侵襲能力的影響：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，si-EPS8組和si-NC組HCC94細(xì)胞的穿膠細(xì)胞數(shù)分別為46.42±12.74個和99.09±20.26個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.403，P=0.005)，表明干擾EPS8可抑制HCC94細(xì)胞的侵襲能力(圖7)。

圖7 干擾EPS8對HCC94細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×100)A.Transwell實(shí)驗(yàn)定量結(jié)果；B.Transwell實(shí)驗(yàn)穿膠細(xì)胞;與si-NC組比較，*P<0.01

10.上調(diào)miR-3074對HCC94細(xì)胞增殖活力的影響：CCK-8法檢測結(jié)果顯示，在第2、3、4、5天，miR-3074組HCC94細(xì)胞A值明顯低于對照組(P<0.05)，提示miR-3074可抑制HCC94細(xì)胞的增殖活力(表2)。

表2 CCK-8檢測miR-3074對HCC94細(xì)胞增殖活力的影響

11.上調(diào)miR-3074對HCC94細(xì)胞侵襲能力的影響：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，miR-3074組和對照組HCC94細(xì)胞的穿膠細(xì)胞數(shù)分別為68.91±9.45個和135.10±14.75個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.777，P=0.009)，表明miR-3074可抑制HCC94細(xì)胞的侵襲能力(圖8)。

圖8 miR-3074對HCC94細(xì)胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×100)A.Transwell實(shí)驗(yàn)定量結(jié)果；B.Transwell實(shí)驗(yàn)穿膠細(xì)胞

討 論

miRNA是一種非編碼的內(nèi)源性單鏈RNA，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，miRNA被證實(shí)廣泛參與細(xì)胞的生理和病理過程[7]。既往研究證實(shí)，miRNA在包括宮頸癌在內(nèi)的惡性腫瘤組織和細(xì)胞中異常表達(dá)，已成為重要的分子診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[8, 9]。miRNA如miR-96、miR-106b、miR-873、miR-612、miR-4429被證實(shí)在宮頸癌組織中異常表達(dá)，發(fā)揮促癌或抑癌的效應(yīng)[10～14]。Lou等[6]研究表明，miR-3074能夠誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬，抑制三陰性乳腺癌的進(jìn)展，提示miR-3074在三陰性乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用。OncoLnc在線數(shù)據(jù)庫顯示，miR-3074表達(dá)水平較高的宮頸癌患者生存期長于miR-3074表達(dá)水平較低的患者，miR-3074高表達(dá)與患者生存期存在相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-3074在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)低于正常宮頸上皮細(xì)胞，過表達(dá)miR-3074可有效抑制宮頸癌HCC94細(xì)胞的增殖活力和侵襲能力，提示miR-3074在宮頸癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。

miRNA通過互補(bǔ)配對結(jié)合下游靶基因mRNA 3′非翻譯區(qū)，在轉(zhuǎn)錄水平導(dǎo)致靶基因mRNA的分解或者翻譯沉默，從而下調(diào)靶基因在細(xì)胞中的表達(dá)[15]。本研究通過生物信息學(xué)軟件RNAhybrid預(yù)測顯示，miR-3074與EPS8mRNA 3′非翻譯區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)。EPS8蛋白廣泛存在于上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，參與調(diào)控細(xì)胞有絲分裂、增殖、分化等過程，是表皮生長因子受體蛋白的重要底物[16]。近年來研究表明，多種惡性腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)EPS8的高表達(dá)，其與腫瘤的高度增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和血管生成顯著相關(guān)，是一種重要的促癌蛋白[17, 18]。研究證實(shí)，EPS8蛋白在宮頸癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞的化療敏感度和患者生存期呈負(fù)相關(guān)，EPS8蛋白可顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19, 20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，干擾EPS8可有效抑制HCC94細(xì)胞的增殖活力和侵襲能力。本研究進(jìn)一步研究顯示，轉(zhuǎn)染miR-3074模擬物可使宮頸癌HCC94細(xì)胞中EPS8表達(dá)被抑制。利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，miR-3074通過作用于EPS8 mRNA 3′非翻譯區(qū)，實(shí)現(xiàn)對EPS8的靶向調(diào)控作用。隨著EPS8基因表達(dá)下降，上皮細(xì)胞表型蛋白ZO-1和Claudin-1表達(dá)增加，間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白Twist表達(dá)減少，提示HCC94細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程受到抑制。以上結(jié)果證實(shí)，miR-3074通過靶向下調(diào)EPS8表達(dá)在HCC94細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，miR-3074在宮頸癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-3074可有效抑制宮頸癌HCC94細(xì)胞的增殖及侵襲，其分子機(jī)制可能與靶向調(diào)控EPS8基因表達(dá)有關(guān)。