郭睿青 蔡 玲 張子龍 張小鵬

盡管人類預(yù)期壽命不斷提高，但許多衰老相關(guān)疾病仍不可避免地影響著老年人的生活質(zhì)量[1]。其中心血管疾病仍然是老年人死亡的主要原因。與年齡相關(guān)的心臟功能下降使得老年人口承受著巨大的負(fù)擔(dān)，開發(fā)能夠改善老年人心臟健康的治療方法仍然是維持人類健康的首要任務(wù)[2]。

心肌細(xì)胞具有高密度的線粒體，線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)偶聯(lián)氧化磷酸化產(chǎn)生腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)為心肌細(xì)胞收縮功能[3]。ETC鏈上復(fù)合體Ⅰ底物分解代謝的輔助因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)也是體內(nèi)許多脫氫酶的輔酶。然而，在應(yīng)激和自然衰老過程中，NAD+在組織中的可用性可能會受到限制[4]。因此，挽救細(xì)胞線粒體NAD+的水平可能是改善人類衰老相關(guān)心臟疾病的有效治療手段。

哺乳動物中煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)是NAD+重要的前體，其功能也主要通過NAD+體現(xiàn)[5]?；ㄒ?、牛肉等食物中含有豐富的NMN，在體內(nèi)，NMN也能夠自發(fā)轉(zhuǎn)化為NAD+[5]。補(bǔ)充NMN是有效提高體內(nèi)NAD+水平的方法。既往研究已經(jīng)證實，短期服用NMN對肥胖并發(fā)癥有顯著的治療效果[6]。此外，NMN通過防止缺血引起的NAD+減少來保護(hù)心臟免受缺血再灌注損傷[7]。本研究通過構(gòu)建老年小鼠模型，同時在飲用水中加入NMN，為期12個月，著重評估心臟功能的變化，并探索潛在的機(jī)制，以期將NMN作為一種解決年齡相關(guān)心功能缺陷的候選藥物。

材料與方法

1.主要試劑與儀器：NMN(N3501)和OxyblotTMprotein oxidation試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司。NAD+檢測試劑盒，BCA蛋白濃度檢測試劑盒，MDA、SOD和ATP檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。磁珠法通用型基因組DNA提取試劑盒(DP705)購自天根生化科技(北京)有限公司。Fast SYBR Green Master Mix試劑盒購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。小鼠代謝籠購自蘇州市馮氏實驗動物設(shè)備有限公司。血糖儀和血糖試紙購自美國羅氏公司。Vevo?3100超聲成像平臺購自日本FUJIFILM公司。RT- PCR儀購自美國Biorad公司。

2.動物分組和模型建立：本研究符合《美國NIH實驗室動物使用指南》規(guī)定，選用30只3月齡雄性C57BL/6J小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于21～22℃恒溫的標(biāo)準(zhǔn)清潔級環(huán)境，每隔12h光暗循環(huán)，自由飲食飲水，飼養(yǎng)至4月齡。采用隨機(jī)分組對照的方法將小鼠分為：年輕組(n=10)小鼠即無其他處理的4月齡小鼠；老年組(n=10)即繼續(xù)飼養(yǎng)至12～16月齡的老年小鼠；實驗組(n=10)小鼠處理參照文獻(xiàn)[8～10]飼養(yǎng)于代謝籠中，記錄24h飲水瓶重量的變化確定每只小鼠每日飲水量7～10ml，按照每日8ml飲水量，水中添加NMN以保證小鼠每天獲取NMN約300mg/kg，飼養(yǎng)至12～16月齡。由于NMN水溶液在室溫下7天內(nèi)保持穩(wěn)定，3天更換一次飲水。老年組和實驗組小鼠在整個飼養(yǎng)過程中每周同一時間測量體質(zhì)量。

3.口服葡萄糖耐量實驗(oral glucose tolerance test，OGTT)：測定年輕組小鼠4月齡，老年組和實驗組小鼠16月齡的葡萄糖耐量。實驗前1天禁食10h，尾靜脈測量空腹血糖，之后腹腔注射2g/kg D-葡萄糖，分別在注射后30、60、90min測量血糖，并計算曲線下面積。

4.心臟超聲檢測：超聲觀察小鼠心臟運動。1%～2%異氟醚麻醉誘導(dǎo)后，仰臥位固定于恒溫板上，胸前區(qū)備皮，穩(wěn)定小鼠心率在500次/分左右，設(shè)置超聲探頭的探測深度為15mm。取胸骨旁左心室短軸切面，記錄并分析M模式下小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction reflecting，LVEF)和左心室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)。胸骨左下側(cè)找到心臟四腔切面，記錄并分析B模式下二尖瓣血流速度得到心室舒張早期和舒張晚期血流速度之比。

5.NAD+含量檢測：具體參照試劑盒說明。稱取20mg心肌組織，剪碎后加入NAD+/NADH提取液冰上進(jìn)行勻漿。隨后12000×g，4℃離10min，取上清作為待測樣品備用。按照相應(yīng)的試劑盒說明進(jìn)行操作。算出NAD總量減去NADH含量即為NAD+含量，BCA法校正蛋白濃度得到NAD+含量。

6.丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及ATP含量檢測：分別稱取20mg心肌組織，充分剪碎后10000×g離心10min，留取上清按照相應(yīng)的試劑盒說明進(jìn)行操作。上清液蛋白濃度使用BCA法定量校正后得到MDA含量、SOD活性和ATP含量。

7.蛋白過氧化水平檢測：提取10mg小鼠心肌總蛋白，定量后取20μg蛋白按照OxyblotTMprotein oxidation試劑盒說明制備樣品，SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%白蛋白在室溫下封閉1h，使用配套的抗體對DNP殘基顯影反映蛋白羰基化程度。用Image J測得總蛋白羰基化灰度值和內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值之比作為蛋白過氧化的相對表達(dá)值。

8.組織基因組DNA提?。喝?0mg心肌組織，盡量剪碎后加入300μl組織消化液GHA和20μl ProteinaseK后充分勻漿研磨組織。按照DNA試劑盒說明提取組織基因組DNA。

9.熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)：使用單拷貝基因煙酰胺腺嘌呤脫氧核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)脫氫酶亞單位1(NADH dehydrogenase subunit1，ND1)和GAPDH基因分別代表線粒體基因組和細(xì)胞核基因組。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，送北京擎科生物科技有限公司合成，序列參照表1。PCR總反應(yīng)體系為8μl：2×SYBR Green master mix 4μl(200μmol/L)，10μmol/L上下游引物各0.5μl，模板DNA 1μl，ddH2O補(bǔ)足體積。反應(yīng)參數(shù)為95℃ 10min；循環(huán)40次：95℃ 15s，60℃ 1min。融解曲線：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。結(jié)果以2-ΔΔCt計算。

表1 熒光定量PCR引物信息

結(jié) 果

1.NMN長期補(bǔ)充改善小鼠衰老相關(guān)表型：從4月齡開始，于飲水中添加NMN [300mg/(kg·d)]喂養(yǎng)小鼠至16月齡(圖1中A、B)。相比常規(guī)喂養(yǎng)的老年組小鼠，實驗組小鼠體質(zhì)量增速減慢，16月齡時體質(zhì)量較輕(P<0.01，P<0.01，圖1中C～E)；OGTT提示，相比4月齡的年輕組小鼠，老年組小鼠葡萄糖耐受能力下降，而添加NMN的老年組小鼠葡萄糖耐量改善(P<0.05，P<0.01，圖1中F、G)。這些結(jié)果提示，長期使用NMN可以改善小鼠衰老進(jìn)程中的肥胖和糖耐量受損。

圖1 喂養(yǎng)4月齡小鼠至16月齡構(gòu)造老年模型A.小鼠模型構(gòu)建示意圖；B.實驗組小鼠喂養(yǎng)示意圖；C.小鼠典型的形態(tài)示意圖；D.小鼠體質(zhì)量增量曲線；E.小鼠體質(zhì)量隨時間變化曲線；F.口服葡萄糖耐量實驗；G.血糖隨時間變化的曲線下面積；*P<0.01，**P<0.001

2.NMN長期補(bǔ)充升高老年小鼠心臟NAD+水平并改善心功能：檢測各組小鼠心臟NAD+含量發(fā)現(xiàn)，相比4月齡小鼠，16月齡的老年小鼠心臟NAD+含量明顯降低，而NMN可以在一定程度上恢復(fù)老年小鼠心臟的NAD+水平(P<0.001，P<0.01，圖2A)。此外，心臟超聲發(fā)現(xiàn)，相比年輕小鼠，老年小鼠E/A比、LVEF、LVFS均下降(P值分別為<0.001、<0.001、<0.01，圖2中B～E)，而NMN處理可以顯著改善上述指標(biāo)。以上結(jié)果說明，長期補(bǔ)充NMN增加老年小鼠心臟NAD+的同時緩解了衰老過程中心臟收縮和舒張功能的下降。

圖2 3組小鼠心臟NAD+水平及心功能檢測A.心臟NAD+水平；B.代表性心臟超聲；C.心室舒張早期與舒張晚期血流速度之比；D.左心室射血分?jǐn)?shù)；E.左心室短軸縮短率；*P<0.01，**P<0.001

3.NMN減輕老年心臟氧化應(yīng)激，恢復(fù)線粒體質(zhì)量：相比年輕小鼠，老年小鼠心肌MDA含量明顯增高(P<0.01)，SOD活性下降(P<0.001)，且羰基化蛋白水平上升(P<0.01)，而補(bǔ)充了NMN的老年小鼠上述指標(biāo)則得到改善(P值分別為<0.05、<0.01、<0.05，圖3中A～D)。檢測心肌ATP含量及mtDNA拷貝數(shù)目發(fā)現(xiàn)，老年小鼠的心肌ATP產(chǎn)生和mtDNA數(shù)目均減少(P<0.001，P<0.001，圖3中E、F)，說明老年小鼠線粒體質(zhì)量受損，而實驗組小鼠心肌ATP含量和mtDNA都有一定恢復(fù)。這些結(jié)果提示NMN可以減輕衰老過程中小鼠心臟的氧化應(yīng)激和線粒體損傷。

圖3 3組小鼠心臟氧化應(yīng)激指標(biāo)及線粒體功能檢測A.心臟MDA含量；B.心臟SOD活性；C.代表性羰基化蛋白修飾免疫印跡；D.羰基化蛋白相對水平；E.心臟ATP含量；F.心臟mtDNA相對表達(dá)量；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

討 論

衰老過程中，NAD+水平會隨著年齡的增長而降低，NMN作為細(xì)胞內(nèi)NAD+合成的關(guān)鍵中間體引起了相關(guān)研究人員的注意。有研究報道，短期服用NMN可以減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖相關(guān)代謝紊亂[6,11]。也有研究發(fā)現(xiàn)NMN對無論是低血糖后葡萄糖再灌注大鼠或是睡眠剝奪小鼠的認(rèn)知與記憶功能都有保護(hù)作用[12，13]。不僅如此，NMN還可以改善經(jīng)歷缺血再灌注損傷及主動脈縮窄的小鼠心功能[7,14,15]。但針對不同疾病模型，NMN的用法、用量有所差異。本研究參考文獻(xiàn)[8～10]，于飲水中添加NMN [300mg/(kg·d)]喂養(yǎng)12個月，證實長期服用NMN能夠緩解小鼠年齡增長所致的代謝相關(guān)生理衰退，如體質(zhì)量增加和葡萄糖耐量受損。并且發(fā)現(xiàn)這一用法、用量對小鼠是可以耐受的，未觀察到明顯的不良反應(yīng)。鑒于衰老過程中心功能減退及其對老年人群壽命和生活質(zhì)量的重要性，本研究考慮長期服用NMN可以作為NAD+補(bǔ)劑進(jìn)行抗衰老干預(yù)，尤其對于心臟是有益的。

隨著年齡的增長，NAD+在小鼠和人體的多個器官或組織中的利用率都會下降，包括骨骼肌、脂肪、腦和心臟[16,17]。本研究觀察到老年小鼠心臟NAD+含量明顯低于年輕小鼠，且長期服用NMN的小鼠心臟NAD+含量有所回升，與既往研究一致[10]。心臟超聲發(fā)現(xiàn)，無論是反映心室舒張功能的E/A比還是反映收縮功能的LVEF和LVFS，NMN補(bǔ)充均可以緩解老年小鼠這些參數(shù)的惡化。在細(xì)胞中，NAD+是許多生化反應(yīng)的輔酶，廣泛參與包括代謝、炎癥、應(yīng)激和損傷反應(yīng)，同時也會不斷地被消耗，如NAD+依賴的去乙?；窼irtuins家族，DNA修復(fù)酶PARP等[4]。在心臟中，由于線粒體含量豐富，NAD+作為呼吸鏈上重要的輔助因子，對整個電子傳遞鏈的穩(wěn)定影響巨大，于是本研究考慮NMN維持了衰老過程中心肌線粒體的穩(wěn)態(tài)而保護(hù)了心功能。

衰老過程中，線粒體功能衰退，DNA斷裂破壞等因素均會造成氧化應(yīng)激增強(qiáng)，而線粒體對活性氧水平極為敏感[17]。檢測膜脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量、體內(nèi)主要抗氧化酶SOD活性及蛋白羰基化水平(蛋白質(zhì)氧化損傷的一種)，老年小鼠心臟MDA含量增多而SOD活性降低，且羰基化的蛋白增多，但NMN補(bǔ)充的小鼠上述指標(biāo)改善[18,19]。線粒體功能障礙也是衰老的一個標(biāo)志，本研究發(fā)現(xiàn)NMN明顯緩解了衰老過程中心肌ATP含量的下降。此外，盡管mtDNA拷貝數(shù)目在衰老過程中不可避免地減少，但NMN對這種趨勢也有一定的抑制作用[20]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)長期補(bǔ)充NMN可以減少小鼠衰老表型及伴隨的心功能損害，可能原因是減輕氧化應(yīng)激而維持了線粒體功能。本研究亦有不足，NMN對衰老小鼠其他組織和器官的作用有待于進(jìn)一步觀察。此外，不同濃度下NMN的廣泛效應(yīng)及安全性還需進(jìn)一步驗證以便能應(yīng)用于臨床。