吳 帆，陳 楠，吳雨卿，倪元穎，溫 馨

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

食物中的膳食營養(yǎng)成分對于維持人體健康至關(guān)重要。在維持溫飽的條件下，世界上仍有數(shù)百萬人營養(yǎng)不良，且越來越多的研究表明，70%以上的慢性死亡與膳食營養(yǎng)成分密切相關(guān)[1]。保證人體攝入足夠膳食化合物的基礎(chǔ)上，如何高效發(fā)揮其功能活性至關(guān)重要。為了保證膳食化合物在人體內(nèi)發(fā)揮作用，其必須在消化過程中從食物基質(zhì)中釋放出來，被人體腸道上皮細(xì)胞吸收且被分配到靶組織利用，而在吸收利用過程中，膳食化合物會受到食物基質(zhì)、加工方法以及膳食成分等因素影響，導(dǎo)致吸收利用程度發(fā)生變化，從而造成功能活性發(fā)揮效果的不同。因此，探究膳食化合物等食物成分在人體內(nèi)吸收利用過程的影響因素，提高吸收利用程度，對于實(shí)現(xiàn)膳食化合物功能活性的高效發(fā)揮具有重要意義。

膳食成分在人體的吸收利用程度常用生物可及性和生物利用度這兩個指標(biāo)進(jìn)行評估：生物可及性是指膳食化合物等經(jīng)過口腔、胃腸道消化，可被小腸細(xì)胞吸收的部分；生物利用度是指吸收的物質(zhì)中可參與體循環(huán)，用于正常生理功能或在人體中存儲的比例[2]。生物可及性和生物利用度可采用動物實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究，但其存在倫理、成本高、實(shí)驗(yàn)周期長等問題，導(dǎo)致適用性差。體外腸道吸收細(xì)胞模型是基于人體內(nèi)胃腸道結(jié)構(gòu)功能和生理環(huán)境，體外研究膳食化合物等食物成分在人體內(nèi)吸收利用度的技術(shù)手段。利用體外模擬胃腸消化模型聯(lián)合細(xì)胞吸收模型能夠更加方便、快速、高效地模擬人體對食物的消化和吸收[3]，從而獲得不同類型和來源的膳食化合物的生物可及性和生物利用度。目前，體外胃腸消化模型通過設(shè)置恒定的膳食與口腔、胃和小腸消化液的比例，真實(shí)還原體內(nèi)消化環(huán)境，已實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化[4-5]，且經(jīng)過進(jìn)一步修正已成功應(yīng)用于膳食化合物的體外消化[6-7]。同時，腸道細(xì)胞吸收模型正在迅速發(fā)展且廣泛應(yīng)用，已實(shí)現(xiàn)單層細(xì)胞模型到共培養(yǎng)細(xì)胞模型、2D模型到3D模型、靜態(tài)細(xì)胞吸收模型到動態(tài)細(xì)胞吸收模型的發(fā)展，成為研究膳食化合物等食物成分的有力工具，但目前仍沒有能夠較好地模擬人體腸道細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)化腸道細(xì)胞吸收模型。

因此，本文綜述人體腸道細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，總結(jié)現(xiàn)有的體外腸道細(xì)胞吸收模型研究進(jìn)展，同時以類胡蘿卜素為代表，探討體外腸道細(xì)胞吸收模型在模擬人體類胡蘿卜素腸道吸收上的應(yīng)用，并對利用體外腸道細(xì)胞吸收模型研究膳食化合物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的發(fā)展方向進(jìn)行展望，以期為利用體外腸道細(xì)胞吸收模型研究人體膳食化合物的吸收利用提供借鑒。

1 人體腸道細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能

腸道是人體吸收營養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵部位，明確不同腸道細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能對于研究營養(yǎng)物質(zhì)在人體的生物利用度以及模擬構(gòu)建體外細(xì)胞吸收模型極其重要。在人體腸道中，腸黏膜上皮組織作為一道“吸收性屏障”能夠?qū)崿F(xiàn)腸道的主要功能，其主要由選擇性吸收營養(yǎng)物質(zhì)的腸上皮細(xì)胞、分泌黏蛋白的杯狀細(xì)胞、呈遞抗原的微褶皺細(xì)胞和分泌溶菌酶的潘氏細(xì)胞等構(gòu)成[8-10]（圖1）。其中腸上皮細(xì)胞間連接方式主要包括緊密連接、黏附連接、橋粒連接和縫隙連接4 種[11]，而緊密連接是最重要的連接方式，通過封閉細(xì)胞間隙，形成了連續(xù)的質(zhì)膜融合帶，可防止細(xì)胞間隙中的物質(zhì)或外部物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞間隙時溢出[12-13]。此外，根據(jù)空間位置的不同，腸黏膜分為頂端膜（又稱腸腔側(cè)膜）和基底側(cè)膜[14]，二者已成為物質(zhì)經(jīng)腸黏膜上皮細(xì)胞吸收利用的基本途徑。腸黏膜上皮組織表面存在一些微小的凸起絨毛，絨毛的存在大大增加了腸道內(nèi)壁的表面積，從而實(shí)現(xiàn)對食物營養(yǎng)物質(zhì)的最大吸收。腸絨毛下凹進(jìn)入固有層形成腸腺，腸腺開口即為隱窩，隱窩處存在大量的腸干細(xì)胞[15]，這些干細(xì)胞通過“不對稱分裂”的方式沿著隱窩縱軸向上遷移至頂部絨毛上層[8]，影響腸道上皮細(xì)胞的更新?lián)Q代。

圖1 人體腸道細(xì)胞結(jié)構(gòu)[16]Fig.1 Structure of human intestinal cells[16]

2 體外腸道吸收細(xì)胞模型研究進(jìn)展

為全面模擬人體腸道細(xì)胞吸收環(huán)境，近年來體外腸道吸收細(xì)胞模型逐漸完善，主要分為單細(xì)胞培養(yǎng)模型、共培養(yǎng)模型、3D模型以及微流體模型4 類。

2.1 單細(xì)胞培養(yǎng)模型

目前用于營養(yǎng)功能物質(zhì)腸道吸收研究的細(xì)胞主要是Caco-2細(xì)胞，其來源于人結(jié)腸癌細(xì)胞，具有結(jié)構(gòu)簡單、適用性廣且成本較低等優(yōu)點(diǎn)[17]，且能夠表達(dá)腸道內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞的形態(tài)和生理功能，可作為腸道吸收細(xì)胞模型優(yōu)化的基礎(chǔ)細(xì)胞。Caco-2細(xì)胞模型的建立如圖2所示，將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)在Transwell上腔室，培養(yǎng)期間細(xì)胞生長聚合，自發(fā)分化，細(xì)胞頂部（腸腔側(cè)）逐漸形成具有微絨毛的刷狀緣，細(xì)胞之間形成緊密連接，并可以表達(dá)多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝酶類，最終形成一層極化的吸收性腸細(xì)胞層[18]。該細(xì)胞模型應(yīng)用廣泛，常與體外消化模型結(jié)合，用于模擬營養(yǎng)功能物質(zhì)在人體內(nèi)的消化吸收過程，在食品和醫(yī)藥等方面具有重要研究作用。

圖2 Caco-2細(xì)胞模型示意圖[17]Fig.2 Schematic diagram of Caco-2 cell model[17]

Caco-2單細(xì)胞模型雖然是目前應(yīng)用最廣泛的腸道吸收細(xì)胞模型，但其也存在一些問題。該細(xì)胞模型是靜態(tài)細(xì)胞模型，無法模擬腸道細(xì)胞動態(tài)變化過程，缺乏黏液層，且無法在刷狀緣微絨毛的表面高效表達(dá)所有腸道細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，難以高度模擬人體腸道細(xì)胞的生理?xiàng)l件和結(jié)構(gòu)功能。因此，為更好地模擬人體腸道吸收過程，需要在Caco-2單細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代科技儀器和理論知識進(jìn)一步建立更貼近真實(shí)腸道細(xì)胞的體外細(xì)胞模型以滿足不同研究需求。

2.2 共培養(yǎng)模型

人體腸道細(xì)胞是由不同種類、不同功能的細(xì)胞類群組成的，其吸收功能需要多細(xì)胞協(xié)作實(shí)現(xiàn)，因此，將不同特性的單細(xì)胞模型利用細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建更貼近實(shí)際的體外腸道細(xì)胞模型就顯得尤為必要。腸道細(xì)胞共培養(yǎng)模型主要是以Caco-2細(xì)胞模型為基礎(chǔ)，結(jié)合其他細(xì)胞形成更成熟的體外腸道細(xì)胞模型，目前應(yīng)用較多的主要包括Caco-2/HT29-MTX細(xì)胞共培養(yǎng)模型和Caco-2/靶細(xì)胞共培養(yǎng)模型兩大類。

2.2.1 Caco-2/HT29-MTX細(xì)胞共培養(yǎng)模型

通過改變培養(yǎng)條件，可以使HT29細(xì)胞以不同路徑分化，形成具有不同功能的腸道細(xì)胞[19]。其中，HT29-MTX細(xì)胞是由HT29細(xì)胞定向分化而來的杯狀細(xì)胞，其可以分泌黏液，從而更加真實(shí)地模擬腸道細(xì)胞黏液層吸收屏障功能[20]。利用Caco-2細(xì)胞模型提供緊密細(xì)胞結(jié)構(gòu)，保障細(xì)胞屏障功能，同時利用HT29-MTX細(xì)胞分泌黏液生成黏液層，進(jìn)一步鞏固細(xì)胞屏障功能，構(gòu)建Caco-2/HT29-MTX細(xì)胞共培養(yǎng)模型，能夠更好地模擬人體腸道細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能和生理?xiàng)l件。Caco-2/HT29-MTX共培養(yǎng)細(xì)胞模型主要用于模擬人體腸道細(xì)胞對營養(yǎng)功能物質(zhì)的吸收及對細(xì)胞屏障功能影響的研究，但在模型建立過程中，由于兩種細(xì)胞生長速度不一致，且不同的細(xì)胞比例會產(chǎn)生不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此需要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整兩種細(xì)胞比例及定向培養(yǎng)HT29-MTX細(xì)胞的條件?，F(xiàn)有研究表明，Caco-2細(xì)胞與HT29-MTX細(xì)胞個數(shù)比為9∶1時[21-22]，共培養(yǎng)模型最接近人體腸道細(xì)胞。Caco-2/HT29-MTX細(xì)胞模型如圖3所示。

圖3 Caco-2/HT29-MTX細(xì)胞模型示意圖[23]Fig.3 Schematic diagram of Caco-2/HT29-MTX cell model[23]

2.2.2 Caco-2/靶細(xì)胞共培養(yǎng)模型

Caco-2細(xì)胞可與人體內(nèi)可分泌內(nèi)源性介質(zhì)的肝細(xì)胞和免疫細(xì)胞等結(jié)合，構(gòu)建分層共培養(yǎng)模型，以研究功能活性物質(zhì)經(jīng)吸收后的功效表達(dá)效果。如圖4所示，將生長在Transwell上腔室內(nèi)的Caco-2單細(xì)胞層與基底層中的靶細(xì)胞間隔培養(yǎng)，模擬人體吸收物質(zhì)后發(fā)揮功能活性的作用機(jī)制，該模型主要應(yīng)用于腸道細(xì)胞免疫機(jī)理以及毒理學(xué)方面研究，但目前鮮見其在膳食化合物吸收研究中的應(yīng)用。

圖4 Caco-2/靶細(xì)胞模型（A）及分層共培養(yǎng)示意圖（B）[23]Fig.4 Schematic diagram of Caco-2/target cell model (A) and layered co-culture (B)[23]

共培養(yǎng)細(xì)胞模型可以在一定程度上彌補(bǔ)單細(xì)胞模型的缺陷，進(jìn)一步真實(shí)模擬人體腸道細(xì)胞功能，但其在模型構(gòu)建時需考慮不同種類細(xì)胞特性，其培養(yǎng)條件嚴(yán)格、過程繁瑣、不確定因素較多，且單細(xì)胞和共培養(yǎng)模型中的細(xì)胞間作用僅限于水平面，無法重現(xiàn)腸道細(xì)胞立體作用；因此，需更深入研究方便快速且能夠重現(xiàn)腸道細(xì)胞環(huán)境的體外細(xì)胞模型。此外，腸道細(xì)胞中黏液層的面積及黏液中黏蛋白濃度等會對膳食化合物的吸收利用產(chǎn)生影響，但體外細(xì)胞模型中黏液層對膳食化合物吸收利用的影響目前研究較少，其影響機(jī)制需進(jìn)一步研究。

2.3 3D模型

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，干細(xì)胞、類器官研究興起，為進(jìn)一步模擬人體腸道細(xì)胞的真實(shí)狀態(tài)，研究者們在單細(xì)胞、共培養(yǎng)等2D細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上利用干細(xì)胞、類器官等誘導(dǎo)分化構(gòu)建3D模型[24]，以期實(shí)現(xiàn)體外模擬人體腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)等多種功能。

干細(xì)胞處于腸道細(xì)胞隱窩部分，能夠自發(fā)分化組織成隱窩絨毛結(jié)構(gòu)，具有自更新和自組織能力，同時可誘導(dǎo)分化形成多種腸道細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)腸道細(xì)胞功能活性。Sato等[25]報道了腸隱窩細(xì)胞的分離和自更新能力，當(dāng)其被包埋在凝膠水膠體內(nèi)，在含生長分化因子的混合物培養(yǎng)基或與分泌這些因子的細(xì)胞共培養(yǎng)時，會形成一個封閉的球型單層，從而可以模擬腸道的隱窩絨毛細(xì)胞連續(xù)體。但包埋在基質(zhì)凝膠水膠體中的3D隱窩絨毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)不能提供絨毛刷狀邊緣的物質(zhì)吸收通道，造成膳食化合物等物質(zhì)吸收利用時的區(qū)域特異性[26]。

腸道類器官是基于誘導(dǎo)分化多種干細(xì)胞構(gòu)建，根據(jù)細(xì)胞來源不同可分為胚胎干細(xì)胞和隱窩腸干細(xì)胞分化的兩種腸道類器官。由于干細(xì)胞材料稀缺且成本較高，再加上類器官封閉似的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，增大了操作難度，因此其目前用于膳食化合物的吸收利用研究較少，主要應(yīng)用于菌群檢測及臨床醫(yī)學(xué)等方面研究。

如圖5所示，在2D模型細(xì)胞間水平作用的基礎(chǔ)上，腸道細(xì)胞3D模型能夠模擬腸道細(xì)胞-細(xì)胞以及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，進(jìn)一步重現(xiàn)腸道細(xì)胞功能。同時，由于人體腸道細(xì)胞經(jīng)常接觸信號刺激分子和不同濃度的營養(yǎng)物質(zhì)，3D模型中細(xì)胞培養(yǎng)位于干細(xì)胞聚集體或類器官的中心[24]，細(xì)胞很難暴露并接觸培養(yǎng)基中濃度均勻的信號分子和營養(yǎng)物質(zhì)，因此，可以更好地模擬腸道微環(huán)境。但是3D模型屬于封閉式結(jié)構(gòu)，在研究膳食化合物吸收利用方面存在取樣困難、條件嚴(yán)格、材料稀缺等問題，同時構(gòu)建3D模型需考慮食品基質(zhì)（黏度、形狀等）的影響，因此需根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)需求構(gòu)建具體的3D模型。

圖5 腸道細(xì)胞3D模型示意圖[23]Fig.5 Schematic diagram of 3D model of intestinal cells[23]

2.4 微流體模型

體外細(xì)胞模型的發(fā)展趨向于真實(shí)模擬人體腸道細(xì)胞環(huán)境，一些細(xì)胞功能的問題逐漸得到解決，而細(xì)胞模型的非生理性缺陷仍存在，需進(jìn)一步研究動態(tài)細(xì)胞模型從而更加真實(shí)地模擬腸道物理環(huán)境。如圖6所示，微流體模型的構(gòu)建是基于流體持續(xù)流動的腔室，將細(xì)胞培養(yǎng)在腔室上，流體持續(xù)流動帶動細(xì)胞有節(jié)奏地伸展[27]，模擬腸道細(xì)胞的伸縮性和剪切力，構(gòu)建微流體細(xì)胞模型。微流體模型中細(xì)胞分化速度快，形成緊密的細(xì)胞屏障，且與體內(nèi)腸細(xì)胞具有更相似的垂直高度[27]，更接近人體腸道細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

圖6 腸道細(xì)胞微流體模型示意圖[23]Fig.6 Schematic diagram of microfluidic model of intestinal cells[23]

器官芯片是微流體模型中的一種細(xì)胞培養(yǎng)裝置，能夠幾乎重現(xiàn)人體腸道細(xì)胞的功能和環(huán)境。目前，有研究報道了基于聚二甲基硅氧烷設(shè)計和制造的腸道微流控芯片可實(shí)時、持續(xù)地監(jiān)測腸道細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量[28]。Bein等[29]研發(fā)了基于Caco-2細(xì)胞和其他上皮細(xì)胞構(gòu)建的腸道芯片，利用腸腔側(cè)和基底側(cè)流體壓力的變化使模擬腸道組織循環(huán)機(jī)械運(yùn)動以模擬腸道蠕動，能刺激體外細(xì)胞模型形成腸道絨毛結(jié)構(gòu)，可以在保證黏液分泌的同時增加腸道細(xì)胞功能的表達(dá)。為更好地構(gòu)建腸道類器官的隱窩與絨毛結(jié)構(gòu)，Shin等[30]結(jié)合干細(xì)胞分化而來的類器官構(gòu)建了腸道類器官-微流控芯片模型。Tsamandouras等[31]通過將單層分化、共培養(yǎng)的Caco-2和HT29-MTX細(xì)胞構(gòu)建在由初代肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞組成的肝芯片上，建立了腸-肝模型微流體系統(tǒng)。Chen等[32]結(jié)合原代腸細(xì)胞培養(yǎng)物的腸芯片和含有共培養(yǎng)HepG2細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的肝芯片構(gòu)建了腸-肝芯片微流體系統(tǒng)。目前，在器官芯片持續(xù)發(fā)展過程中，已有研究構(gòu)建了腸-肝-皮膚-腎四器官芯片模型[33]，這使得體外完全重建腸道細(xì)胞已成為可能，對于進(jìn)一步探究腸道細(xì)胞吸收機(jī)制具有重要意義。

2.5 腸道細(xì)胞模型的驗(yàn)證

腸道細(xì)胞模型的成功建立，是保證開展腸道細(xì)胞吸收機(jī)制研究的基礎(chǔ)，因此，需要對細(xì)胞的生長狀態(tài)、完整性和分化特征進(jìn)行檢測，具體檢測指標(biāo)如表1所示。細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，可通過光學(xué)顯微鏡直接觀察細(xì)胞生長形態(tài)，利用噻唑藍(lán)法測定細(xì)胞生長曲線，觀察細(xì)胞生長動態(tài)過程。測定細(xì)胞層的跨膜電阻（transendothelial electrical resistance，TEER）是驗(yàn)證細(xì)胞單層膜完整性最為簡單易行的方法[34]。隨著培養(yǎng)時間的延長，腸道細(xì)胞緊密連接逐漸成熟，TEER與細(xì)胞連接的緊密程度密切相關(guān)，TEER越大，細(xì)胞緊密程度越高，故可通過運(yùn)用跨膜電阻儀檢測細(xì)胞模型的TEER，從而檢測細(xì)胞單層膜的致密程度。當(dāng)TEER恒定時，表明細(xì)胞緊密連接達(dá)到一定程度，通過檢測熒光黃的跨膜通透性進(jìn)一步檢測細(xì)胞單層膜的完整性。檢測細(xì)胞培養(yǎng)過程中的分化特征有兩種辦法：1）測定細(xì)胞膜兩側(cè)和細(xì)胞內(nèi)部的堿性磷酸酶活性的動態(tài)變化[24]；2）直接用電子顯微鏡觀察腸道細(xì)胞形態(tài)，可通過將多孔膜從培養(yǎng)室取下，固定多孔膜上的細(xì)胞，經(jīng)包埋切片后使用電子顯微鏡觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)極化、細(xì)胞間的緊密連接、橋粒和刷狀邊緣是否形成，從而判斷細(xì)胞分化程度[35]。綜合考慮細(xì)胞模型全部檢測指標(biāo)可判定細(xì)胞模型是否建立成功。

表1 構(gòu)建模型的檢測指標(biāo)[34-35]Table 1 Indicators for construction of detection models[34-35]

3 腸道吸收細(xì)胞模型在類胡蘿卜素上的應(yīng)用

3.1 類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)和功能

類胡蘿卜素是自然界中除葉綠素外最豐富的天然色素，是呈黃色、橙色或紅色的四萜類物質(zhì)，均具有聚異戊二烯結(jié)構(gòu)[36]。類胡蘿卜素種類豐富，共750余種，廣泛存在于動物、植物、微生物以及藻類中。根據(jù)官能團(tuán)可以分為烴類和含氧類胡蘿卜素兩大類，其中常見的類胡蘿卜素有6 種，其結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)功能及主要食物來源如表2所示。

表2 常見類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)功能及主要食物來源Table 2 Structures,nutritional functions and major food sources of common carotenoids

類胡蘿卜素在自然界中具有不可替代的作用。對于植物來說，類胡蘿卜素作為色素成分之一，既可以在光合作用中起到輔助色素的作用[36]，又可以在評價植物外觀及營養(yǎng)品質(zhì)上起到關(guān)鍵作用。對于動物來講，類胡蘿卜素在其生長發(fā)育與健康方面起著重要的作用，具有作為維生素A原、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防心血管疾病等生理活性功能[36-38,42-43]，是一類對視覺和神經(jīng)系統(tǒng)等具有重要營養(yǎng)價值和功能活性的物質(zhì)。但由于類胡蘿卜素具有特殊的聚異戊二烯結(jié)構(gòu)，脂溶性強(qiáng)、不溶于水[49]，且其高度不飽和結(jié)構(gòu)使其極不穩(wěn)定，對光、熱、金屬離子等敏感[50]，同時在消化吸收過程中易受到食物基質(zhì)、存在形式、宿主因素等影響[51]，因此類胡蘿卜素生物利用度較低。在目前發(fā)現(xiàn)的750多種類胡蘿卜素中，人類正常飲食中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有50多種，但其中只有10余種能夠在人體中檢測到，且吸收利用度較低，有人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，β-胡蘿卜素的生物利用度為4%～14%，而番茄紅素的生物利用度僅為0.1%～1.5%[52]。因此，研究影響類胡蘿卜素吸收利用度的內(nèi)源性和外源性因素，以提出合理建議從而提高其吸收利用度極為重要。

3.2 類胡蘿卜素的腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制

腸上皮細(xì)胞作為腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的關(guān)鍵部位，主要分為細(xì)胞旁途徑轉(zhuǎn)運(yùn)和跨細(xì)胞膜途徑轉(zhuǎn)運(yùn)兩種轉(zhuǎn)運(yùn)方式，其中跨細(xì)胞膜途徑轉(zhuǎn)運(yùn)又分為被動擴(kuò)散、轉(zhuǎn)胞吞作用和主動擴(kuò)散[53]。類胡蘿卜素的腸道吸收如圖7所示，類胡蘿卜素在被人體吸收利用時，通常在經(jīng)過口腔和胃的消化作用后分散溶解在脂質(zhì)乳液中進(jìn)入腸道，在腸道內(nèi)經(jīng)過胰液和膽汁的雙重消化，脂質(zhì)被水解，類胡蘿卜素與膽固醇、脂質(zhì)消化物以及膽鹽等形成混合膠束，膠束可通過黏蛋白層擴(kuò)散到排列于腸腔邊界的吸收性上皮細(xì)胞表面[51]。膠束到達(dá)上皮細(xì)胞表面后，其中的脂肪酸在微酸性環(huán)境下質(zhì)子化，從膠束中脫離，膠束解離后，類胡蘿卜素釋放[54]，并通過特定的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)入腸道細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)一步發(fā)揮其生理功能。

圖7 類胡蘿卜素的腸道吸收Fig.7 Intestinal absorption of carotenoids

過去研究者認(rèn)為類胡蘿卜素的腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制為簡單的被動擴(kuò)散[44,55]。Tyczkowski等[56]通過研究蛋雞小腸細(xì)胞對游離葉黃素的吸收，發(fā)現(xiàn)在腸道細(xì)胞中存在游離態(tài)、單酯、二酯3 種形式的葉黃素，且轉(zhuǎn)運(yùn)過程中均以未結(jié)合的形式存在，沿濃度梯度被動吸收，為被動擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。陳波等[57]利用犢牛和仔雞的離體小腸細(xì)胞進(jìn)行β-胡蘿卜素和葉黃素的體外吸收實(shí)驗(yàn)，研究類胡蘿卜素濃度、游離脂肪酸和吐溫20對其吸收的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種類胡蘿卜素的吸收均呈濃度依賴性，為典型的被動擴(kuò)散模型。但通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素的吸收在個體間存在一定差異，在細(xì)胞水平存在順反異構(gòu)體的選擇性[18]，以及與其他物質(zhì)具有一定的相互作用，轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制不是簡單的被動擴(kuò)散，還需要載體蛋白介導(dǎo)的主動運(yùn)輸[54,57]。陳葉等[58]通過Caco-2細(xì)胞模型測定膠束化對葉黃素腸道細(xì)胞攝取、表觀滲透系數(shù)和細(xì)胞內(nèi)吞的影響，結(jié)果表明膠束化處理顯著提高了葉黃素的生物利用度，且其在腸道細(xì)胞中的跨膜吸收途徑以被動擴(kuò)散為主，兼具網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)和小窩/脂筏蛋白介導(dǎo)的主動運(yùn)輸。Borel等[59]采用Caco-2細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶白細(xì)胞分化抗原（cluster of differentiation 36，CD36）參與VA前體物質(zhì)α-胡蘿卜素和β-隱黃素的攝取。

不同類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制不盡相同，大多以被動擴(kuò)散為基礎(chǔ)，同時存在特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主動擴(kuò)散的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，目前鑒定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要以脂質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為主。目前已報道的類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)運(yùn)方式總結(jié)如表3所示。類胡蘿卜素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與其結(jié)合載體存在一定的關(guān)聯(lián)，通過不同轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制吸收時其生物利用度可能存在一定的差異，因此，需要進(jìn)一步考慮不同轉(zhuǎn)運(yùn)方式及轉(zhuǎn)運(yùn)速率對類胡蘿卜素的“高吸收利用”或“低吸收利用”表型的影響，從而制定合理的飲食建議優(yōu)化類胡蘿卜素在人體的消化吸收，最大化其對人體的健康益處。

3.3 腸道吸收細(xì)胞模型在類胡蘿卜素上的應(yīng)用

目前已應(yīng)用于類胡蘿卜素腸道吸收研究的體外細(xì)胞模型主要包括Caco-2單層細(xì)胞模型和Caco-2/HT29-MTX共培養(yǎng)細(xì)胞模型兩種，相關(guān)研究如表3所示。

表3 體外腸道吸收細(xì)胞模型在類胡蘿卜素上的應(yīng)用總結(jié)Table 3 Summary of recent studies on transport mechanism of carotenoids in in vitro intestinal cell models

3.3.1 Caco-2單層細(xì)胞模型在類胡蘿卜素上的應(yīng)用

Caco-2單層細(xì)胞模型是研究類胡蘿卜素吸收應(yīng)用最廣泛的體外細(xì)胞模型。Chitchumroonchokcai等[61]通過建立Caco-2體外細(xì)胞模型研究玉米黃素酯的酶解對腸道細(xì)胞攝取玉米黃素的影響，結(jié)果表明玉米黃素酯經(jīng)羧基酯脂肪酶水解后產(chǎn)生游離態(tài)玉米黃素會促進(jìn)其膠束化，從而提高其生物利用度，此外，在玉米黃素酯和游離態(tài)玉米黃素同時存在時，細(xì)胞會優(yōu)先攝取游離態(tài)玉米黃素。Murador等[73]利用Caco-2單層細(xì)胞模型對比常規(guī)提取和離子液提取兩種方法對桔皮中類胡蘿卜素和葉綠素生物利用度的影響時發(fā)現(xiàn)，Caco-2單層細(xì)胞對離子液提取物中類胡蘿卜素和葉綠素的攝取量（243.8～234.2 ng/mg細(xì)胞蛋白）是常規(guī)方法提取物中（130.2～131.6 ng/mg細(xì)胞蛋白）的近兩倍。Zhong Siqiong等[20]利用Caco-2細(xì)胞模型研究了新型食品加工技術(shù)PEF和OH對番茄汁、超高壓處理和PEF對羽衣甘藍(lán)汁中類胡蘿卜素的生物可及性和細(xì)胞吸收的影響，結(jié)果表明，對于番茄汁，PEF處理使番茄汁中番茄紅素的生物可及性提高了50%，但β-胡蘿卜素的生物可及性降低了44%，PEF和OH兩種處理均促進(jìn)了細(xì)胞對葉黃素的吸收，而對于羽衣甘藍(lán)汁，PEF處理會降低果汁中的β-胡蘿卜素和葉黃素含量，超高壓處理對于果汁中類胡蘿卜素和顏色保護(hù)效果最佳，但二者均未影響其生物可及性和細(xì)胞吸收。

3.3.2 Caco-2/HT29-MTX共培養(yǎng)細(xì)胞模型在類胡蘿卜素上的應(yīng)用

Caco-2/HT29-MTX共培養(yǎng)細(xì)胞模型基于Caco-2單細(xì)胞模型進(jìn)一步真實(shí)還原人體腸道結(jié)構(gòu)和生理?xiàng)l件，已應(yīng)用于類胡蘿卜素等膳食化合物吸收利用的體外研究。Kaulmann等[71]分別采用Caco-2單細(xì)胞模型和Caco-2/HT29-MTX共培養(yǎng)細(xì)胞模型體外模擬研究腸道細(xì)胞對采用不同加工方式的李科和十字花科果蔬中類胡蘿卜素和多酚物質(zhì)的吸收，其結(jié)果表明蒸煮對多酚物質(zhì)生物利用度有影響，但對類胡蘿卜素?zé)o影響，且通過對比Caco-2單細(xì)胞和Caco-2/HT29-MTX共培養(yǎng)細(xì)胞對類胡蘿卜素的吸收率，發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)胞的黏液層對類胡蘿卜素的吸收利用有一定的積極影響。Gasa-Falcon等[72]利用Caco-2單細(xì)胞和Caco-2/HT29-MTX共培養(yǎng)細(xì)胞兩種模型探究卵磷脂或酪蛋白酸鈉包埋兩種β-胡蘿卜素納米乳液在腸道屏障上的生物活性和生物利用度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于酪蛋白酸鈉包埋納米乳液，β-胡蘿卜素經(jīng)Caco-2單細(xì)胞吸收的生物利用度約是Caco-2/HT29-MTX共培養(yǎng)細(xì)胞吸收的1.8 倍；對于卵磷脂穩(wěn)定的納米乳液，β-胡蘿卜素經(jīng)Caco-2單細(xì)胞吸收的生物利用度約是Caco-2/HT29-MTX共培養(yǎng)細(xì)胞吸收的3.3 倍，結(jié)果表明，Caco-2/HT29-MTX共培養(yǎng)細(xì)胞分泌的黏液層在一定程度上會影響類胡蘿卜素的吸收。上述兩項(xiàng)研究所得到的結(jié)論截然不同，因此，未來需要更多的研究探索兩種細(xì)胞模型對不同食品中類胡蘿卜素吸收利用的影響，以明確黏液層對類胡蘿卜素吸收的影響及機(jī)制。

4 結(jié)語

膳食成分在維持人體生理功能、健康生長方面至關(guān)重要，但在腸道細(xì)胞中的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)受到諸多因素影響，人體能夠吸收利用的比例少之又少。因此，通過構(gòu)建體外細(xì)胞模型闡明人體腸道細(xì)胞對膳食化合物的吸收利用機(jī)制具有重要意義。Caco-2單細(xì)胞模型是研究人體膳食化合物吸收利用的最廣泛使用的細(xì)胞模型，其結(jié)構(gòu)簡單，存在絨毛結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間連接緊密，可較好地模擬人體腸道細(xì)胞吸收和屏障保護(hù)功能，但其無法分泌黏液，且無法模擬腸道細(xì)胞動態(tài)吸收過程，需進(jìn)一步改進(jìn)以更好地模擬人體腸道環(huán)境。Caco-2/HT29-MTX細(xì)胞共培養(yǎng)模型在Caco-2單細(xì)胞的優(yōu)勢基礎(chǔ)上結(jié)合HT29-MTX單細(xì)胞優(yōu)勢，既形成了絨毛結(jié)構(gòu)，細(xì)胞緊密連接，又可以分泌黏液，形成黏液層，能夠進(jìn)一步真實(shí)模擬腸道細(xì)胞吸收功能和生理環(huán)境，但兩種細(xì)胞培養(yǎng)條件及比例需嚴(yán)格控制。Caco-2/靶細(xì)胞共培養(yǎng)模型是基于人體吸收基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究物質(zhì)吸收后到達(dá)靶細(xì)胞發(fā)揮功效的作用機(jī)制，但目前應(yīng)用于膳食化合物的研究較少，主要用于藥物毒理研究。隨著分析方法和儀器的進(jìn)步以及研究的深入，體外腸道細(xì)胞模型逐漸成熟，通過3D模型可以在模擬腸道細(xì)胞功能活性的同時模擬細(xì)胞-細(xì)胞水平間作用以及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)的垂直作用，而通過微流體裝置可以動態(tài)再現(xiàn)人體腸道環(huán)境。但需要強(qiáng)調(diào)的是，無論是2D、3D靜態(tài)模型，還是微流體、器官芯片等動態(tài)裝置，都不是復(fù)制人體腸道細(xì)胞或器官，而是模擬腸道細(xì)胞或器官的結(jié)構(gòu)、功能和環(huán)境，不涉及倫理問題。

作為一種廣泛存在的膳食營養(yǎng)成分，類胡蘿卜素在維持人體生理功能和預(yù)防疾病等方面至關(guān)重要。目前應(yīng)用于類胡蘿卜素吸收研究的體外腸道細(xì)胞模型較少，主要有Caco-2單細(xì)胞模型和Caco-2/HT29-MTX細(xì)胞共培養(yǎng)模型兩種。研究人體對類胡蘿卜素等膳食化合物的吸收利用時，需要根據(jù)食物基質(zhì)、膳食化合物結(jié)構(gòu)特性以及模型特點(diǎn)等方面綜合考慮體外腸道吸收細(xì)胞模型的適用性，而目前用于類胡蘿卜素等膳食化合物腸道吸收研究的體外模型仍存在一定局限性。未來如果在體外腸道細(xì)胞模型的改進(jìn)和完善上能實(shí)現(xiàn)絨毛和黏液層等腸道結(jié)構(gòu)功能的模擬、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶類等活性分子的高效表達(dá)以及腸道細(xì)胞蠕動等生理環(huán)境的再現(xiàn)等，將會促進(jìn)更多關(guān)于人體對膳食化合物吸收利用機(jī)制的新見解產(chǎn)生，從而為通過膳食改善人體營養(yǎng)健康提供更高效的解決方案。