張麗媛，劉丹丹，李海燕，王同玲，陸 恒，楊瑞瑞，王 浩，丁玉松,*

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆第二醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 克拉瑪依 834000）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是一類(lèi)以糖脂代謝紊亂為特征的代謝性疾病[1]，胰島β細(xì)胞功能衰竭是T2DM發(fā)展的核心機(jī)制，有研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期暴露在高水平的游離脂肪酸和葡萄糖條件下，最終導(dǎo)致胰島β細(xì)胞受損引起胰島素的分泌減少[2]。然而，高糖高脂（high glucose and high fat，GP）環(huán)境下胰島β細(xì)胞受損的機(jī)制尚未完全闡明。

鐵死亡是由于鐵的過(guò)量累積導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的一種新型調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式[3]，其主要表現(xiàn)形式為鐵沉積、ROS累積、谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量的鐵貯存與T2DM的高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[4]，體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)飼喂高脂飲食的大鼠補(bǔ)充給予鐵劑能夠加重大鼠胰腺組織的炎癥和氧化損傷[5]，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)高糖能夠誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞鐵沉積[6]。Wei Sen等[7]的研究發(fā)現(xiàn)砷通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵沉積，增加脂質(zhì)過(guò)氧化物的濃度導(dǎo)致胰腺組織發(fā)生鐵死亡。因此，鐵死亡有望成為治療和預(yù)防T2DM的新靶點(diǎn)。

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信號(hào)通路是細(xì)胞抗氧化的關(guān)鍵通路，Nrf2信號(hào)通路被認(rèn)為在T2DM中起著重要的抗氧化作用[8]，且已經(jīng)成為脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下，將Nrf2的基因特異性敲除后增加了細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性，非諾貝特治療通過(guò)上調(diào)Nrf2進(jìn)而抑制細(xì)胞鐵死亡[10]。葡萄籽原花青素提取物（grape seed procyanidin extract，GSPE）是一種天然的多酚類(lèi)化合物，具有抗氧化和降低血糖、血脂的能力，本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GSPE能夠通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路降低糖尿病大鼠的血糖水平，增強(qiáng)組織的抗氧化能力[11]，綜上，GSPE是潛在的治療糖尿病的天然藥物。因此，本研究擬通過(guò)GP干預(yù)小鼠胰腺瘤細(xì)胞MIN6細(xì)胞，建立胰島β細(xì)胞損傷模型。以GSPE進(jìn)行干預(yù)，探討GP是否通過(guò)抑制Nrf2信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡，進(jìn)而探討GSPE是否通過(guò)調(diào)控Nrf2信號(hào)通路拮抗GP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞鐵死亡。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠胰島β細(xì)胞MIN6細(xì)胞（XF0390）購(gòu)自上海富恒生物科技有限公司。

G P 試劑盒 西安鯤鵬科技有限公司；G S P E北京索萊寶公司；ROS、MDA、GSH試劑盒 南京建成生物工程研究所；去鐵胺（deferoxamine，DFO）（10 μmol/L）、RAS選擇性致死（RAS-selective lethal，RSL3）（10 μmol/L）、Erastin（20 μmol/L）、壞死抑制劑壞死抑素1（necrostatin-1，Nec-1）（10 μmol/L）、泛Caspase抑制劑（pan caspase inhibitor，Z-VAD-FMK）（10 μmol/L）、自噬抑制劑氯喹（chloroquine，CQ）（10 μmol/L） 美國(guó)Med Chem Express公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8 assay，CCK8） 安徽白鯊生物公司；兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗血紅素氧化酶1（heme oxygenase-1，HO-1）單克隆抗體、兔抗醌氧化還原酶1（NADPH: quinone oxido-reductase-1，NQO1）單克隆抗體、鐵代謝指標(biāo)兔抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TfR1）單克隆抗體、兔抗二價(jià)金屬離子蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體（divalent metal transporter 1，DMT1）單克隆抗體、兔抗鐵蛋白（ferritin）單克隆抗體、鐵死亡的指標(biāo)蛋白兔抗溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）單克隆抗體、兔抗谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）單克隆抗體、兔抗酰基合成酶長(zhǎng)鏈家族成員4（acylcoa synthetase long-chain family member 4，ACSL4）單克隆抗體 英國(guó)Abcam公司；羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、羊抗鼠IgG 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗鼠β-actin單克隆抗體武漢博士得生物工程有限公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水 蘇州吉瑪基因股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FC酶標(biāo)儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；3111二氧化碳培養(yǎng)箱 世爾科技（阿什威爾）有限公司；SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)、SSW-420-2S電熱恒溫水槽、GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器有限公司；101電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SCIENTZ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；Ti2-LAPP熒光顯微鏡尼康儀器（上海）有限公司；TDL-50B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；MLS-530L立式壓力蒸汽滅菌器普和希健康醫(yī)療器械（上海）有限公司；5200化學(xué)發(fā)光儀 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將細(xì)胞培養(yǎng)于1640完全培養(yǎng)基（由10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%青霉素鏈霉素以及體積分?jǐn)?shù)0.1%β-巰基乙醇配制），放置于37 ℃和5% CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度達(dá)至80%～90%下進(jìn)行后續(xù)操作。

在GP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)，用25 mmol/L葡萄糖和200 μmol/L棕櫚酸鈉混合作為GP試劑，分別干預(yù)細(xì)胞0、12、24、48 h，測(cè)定細(xì)胞活性，篩選GP干預(yù)細(xì)胞最佳時(shí)間；將細(xì)胞分為對(duì)照組（Control組）（僅添加1640完全培養(yǎng)基）、GP組（25 mmol/L葡萄糖和200 μmol/L棕櫚酸鈉）以及不同試劑（10 μmol/L DFO、10 μmol/L RSL3、20 μmol/L Erastin、10 μmol/L Nec-1、10 μmol/L Z-VAD-FMK、10 μmol/L CQ）分別聯(lián)合GP干預(yù)組，干預(yù)細(xì)胞24 h，測(cè)定細(xì)胞活性。

在測(cè)定GSPE對(duì)GP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞毒性損傷的影響時(shí)，通過(guò)不同質(zhì)量濃度0、10、20、30、40、50、75、100 mg/L GSPE分別干預(yù)細(xì)胞24 h，篩選GSPE適宜干預(yù)細(xì)胞的質(zhì)量濃度；然后用質(zhì)量濃度10、20、30 mg/L GSPE聯(lián)合GP分別處理MIN6細(xì)胞24 h，測(cè)定細(xì)胞活性。

在測(cè)定不同質(zhì)量濃度GSPE對(duì)GP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞內(nèi)鐵沉積、脂質(zhì)過(guò)氧化、鐵死亡以及通過(guò)Nrf2/HO-1對(duì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的影響時(shí)，將細(xì)胞分為Control（僅添加1640完全培養(yǎng)基）、GP、10 mg/L GSPE＋GP（L-GSPE）、20 mg/L GSPE＋GP（M-GSPE）組和30 mg/L GSPE＋GP（H-GSPE）組，分別測(cè)定細(xì)胞活性。

1.3.2 細(xì)胞活性檢測(cè)

將MIN6細(xì)胞按照7000 個(gè)/孔接種于96 孔板，在無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。根據(jù)CCK8說(shuō)明書(shū)，每孔加入90 μL完全培養(yǎng)基和10 μL CCK8試劑，置于培養(yǎng)箱1～3 h，檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處每孔的吸光度，以1640完全培養(yǎng)基為空白組，細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下所示，以細(xì)胞存活率表示細(xì)胞活性。

1.3.3 MDA、GSH含量測(cè)定

MDA、GSH含量按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 ROS水平測(cè)定

使用2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）作為探針評(píng)估細(xì)胞ROS水平。將MIN6細(xì)胞以每孔2 mL接種于6 孔板中，與1 μmol/L DCFH-DA孵育30 min，然后用2 mL磷酸鹽緩沖液洗滌3 次。用熒光顯微鏡拍攝細(xì)胞的所有熒光圖像，放大倍數(shù)200，用熒光強(qiáng)度表征ROS水平。

1.3.5 Nrf2小干擾RNA轉(zhuǎn)染

為了探究鐵死亡是否被Nrf2信號(hào)通路調(diào)控，用5 μL/孔Nrf2小干擾RNA（Nrf2 small interfering RNA，Nrf2 siRNA）轉(zhuǎn)染MIN6細(xì)胞培養(yǎng)5 h后，用不同質(zhì)量濃度GSPE（10、20、30 mg/L）聯(lián)合GP培養(yǎng)MIN6細(xì)胞24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于6 孔板中，使其均勻鋪于板底部。取Nrf2 siRNA于10000 r/min離心5 min，將粉末離心至管底，加入62.5 μL的DEPC水，充分溶解。取1.5 mL的離心管。首先配制Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染液，分為A液和B液，A液：取5 μL的Nrf2 siRNA溶液，加入250 μL的無(wú)血清的1640完全培養(yǎng)基，孵育5 min。B液：5 μL的脂質(zhì)體（lipofectamine，Lip）2000溶液，加入250 μL的無(wú)血清的1640完全培養(yǎng)基，孵育5 min。將A液和B液混合，超凈臺(tái)中靜置20 min后，加入6 孔板中，放置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 h后吸出，加入pH 7.4、10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，之后加入GSPE或GP進(jìn)行干預(yù)，Nrf2基因序列：GCAGGACAUGGAUUUGAUUTT（目的RNA序列5’-3’），AAUCAAAUCCAUGUCCUGCTT（目的RNA互補(bǔ)序列5’-3’），分別檢測(cè)Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4、SLC7A11的蛋白表達(dá)水平。

1.3.6 Western blot分析

用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟的冰冷RIPA裂解緩沖液（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）提取蛋白，煮沸在－20 ℃?zhèn)溆?。配制分離膠和濃縮膠后在每孔中加入各組的細(xì)胞蛋白，用不同的恒壓電輻電泳，采用恒壓電輻“三明治”法轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，洗膜，孵一抗過(guò)夜，洗膜，孵二抗，洗膜，進(jìn)行曝光，用Image J軟件定量分析蛋白灰度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。多組間的比較采用單因素方差分析，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞發(fā)生鐵死亡

用25 mmol/L葡萄糖和200 μmol/L棕櫚酸鈉聯(lián)合分別處理細(xì)胞12、24、48 h，結(jié)果如圖1A所示，相較于0 h組，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活性逐漸下降，呈現(xiàn)出時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，綜合考慮選取24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。使用不同的試劑（10 μmol/L DFO、10 μmol/L RSL3、20 μmol/L Erastin、10 μmol/L Nec-1、10 μmol/L Z-VAD-FMK、10 μmol/L CQ）分別聯(lián)合GP干預(yù)MIN6細(xì)胞24 h，DFO是一種小分子鐵螯合劑，被認(rèn)為是一種有效的鐵死亡抑制劑。RSL3是一種通過(guò)抑制GPX4活性來(lái)誘導(dǎo)鐵死亡的小分子化合物，被認(rèn)為是一種有效的鐵死亡觸發(fā)劑，Erastin抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體活性，同時(shí)也是一種有效的鐵死亡誘導(dǎo)劑。Nec-1是一種細(xì)胞壞死抑制劑、Z-VAD-FMK是泛Caspase抑制劑、CQ是一種自噬抑制劑。圖1B顯示，與GP組相比，DFO能夠緩解GP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞死亡（P＜0.05），RSL3和Erastin加重了GP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞死亡（P＜0.05），同時(shí)發(fā)現(xiàn)凋亡抑制劑Nec-1、壞死抑制劑Z-VAD-FMK、自噬抑制劑CQ對(duì)GP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞存活沒(méi)有顯著改善作用（P＞0.05），結(jié)果表明，鐵死亡可能存在于GP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞死亡。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間（A）和試劑（B）干預(yù)對(duì)MIN6細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of culture time (A) and drug (B) interventions on the cell viability of MIN6 cells

2.2 GSPE對(duì)GP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞毒性損傷的影響

用不同質(zhì)量濃度（0、10、20、30、40、50、75、100 mg/L）的GSPE干預(yù)MIN6細(xì)胞24 h后，結(jié)果如圖2A所示，與0 mg/L組相比，GSPE質(zhì)量濃度在10～30 mg/L時(shí)細(xì)胞存活率無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明質(zhì)量濃度10～30 mg/L的GSPE對(duì)MIN6細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著影響。因此，為了研究GSPE處理對(duì)GP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞是否具有保護(hù)作用，進(jìn)一步用質(zhì)量濃度10、20、30 mg/L GSPE聯(lián)合GP處理MIN6細(xì)胞24 h（后同），結(jié)果如圖2B所示，GSPE能夠減輕GP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞的毒性損傷，H-GSPE組（質(zhì)量濃度30 mg/L GSPE）相較于GP單獨(dú)干預(yù)組，細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.05）。

圖2 不同質(zhì)量濃度GSPE對(duì)MIN6細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effect of GSPE on the cell viability of MIN6 cells

2.3 不同質(zhì)量濃度GSPE對(duì)GP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞內(nèi)鐵沉積的影響

圖3顯示，與Control組相比，GP組中的TfR1、DMT1、Ferritin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），經(jīng)過(guò)GSPE的處理后，與GP組相比，TfR1、DMT1、Ferritin蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）。以上結(jié)果表明GP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞死亡過(guò)程中伴隨著鐵水平的升高，經(jīng)過(guò)GSPE處理后能夠減少細(xì)胞內(nèi)的鐵水平。

圖3 不同質(zhì)量濃度GSPE對(duì)MIN6細(xì)胞內(nèi)鐵代謝指標(biāo)Ferritin、DMT1、TfR1蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of GSPE on protein expression levels of Ferritin,DMT1 and TfR1 in MIN6 cells

2.4 不同質(zhì)量濃度GSPE對(duì)GP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡的影響

如圖4A所示，與GP組相比，質(zhì)量濃度20、30 mg/L的GSPE干預(yù)組MDA含量顯著下降（P＜0.05），GSH含量顯著升高（P＜0.05）（圖4B）。相較于Control組，GP組的綠色熒光增強(qiáng)，GSPE處理后細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度減弱（圖4C），這表明GSPE可能是通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)GSH含量，從而增加細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力，降低MDA含量和ROS水平。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了SLC7A11和GPX4、ACSL4的蛋白表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示，與Control組相比，GP組的SLC7A11和GPX4的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），ACSL4的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)GSPE處理后，與GP組相比，中、高劑量GSPE組的SLC7A11蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），低、中、高劑量GSPE組的GPX4蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；中、高劑量GSPE組的ACSL4蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，GP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞死亡的過(guò)程中會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化，這可能是因?yàn)镸IN6細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的過(guò)程中存在脂質(zhì)過(guò)氧化。因此，GP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞死亡的機(jī)制是鐵死亡，GSPE能夠通過(guò)減輕細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制MIN6細(xì)胞鐵死亡。

圖4 不同質(zhì)量濃度GSPE對(duì)MIN6細(xì)胞內(nèi)MDA含量、GSH含量、ROS熒光強(qiáng)度和鐵死亡指標(biāo)GPX4、SLC7A11、ACSL4蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of GSPE on levels of MDA and GSH,fluorescence intensity of ROS,and protein expression of GPX4,SLC7A11 and ACSL4 in MIN6 cells

2.5 不同質(zhì)量濃度GSPE通過(guò)Nrf2/HO-1對(duì)MIN6細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用

由圖5可知，與GP組相比，低、中、高劑量組的GSPE的NQO1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），中、高劑量組GSPE的HO-1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），高劑量組的GSPE的Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），這表明GSPE能夠激活Nrf2，從而提高下游的抗氧化酶HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平，增加MIN6細(xì)胞的抗氧化能力，改善細(xì)胞的損傷，GSPE可能是通過(guò)Nrf2信號(hào)通路來(lái)拮抗GP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞鐵死亡。

圖5 MIN6細(xì)胞內(nèi)Nrf2信號(hào)通路水平Fig.5 Expression levels of proteins associated with Nrf2 signaling pathway in MIN6 cells

2.6 Nrf2 siRNA與GSPE對(duì)MIN6細(xì)胞的作用

以上結(jié)果表明，GSPE可能是通過(guò)Nrf2信號(hào)通路改善GP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞鐵死亡，為了進(jìn)一步研究Nrf2信號(hào)通路與鐵死亡的關(guān)系，用siRNA法對(duì)MIN6細(xì)胞轉(zhuǎn)染，特異性地沉默Nrf2，對(duì)MIN6細(xì)胞轉(zhuǎn)染5 h后，用GP與質(zhì)量濃度30 mg/L GSPE單獨(dú)或者聯(lián)合干預(yù)24 h。由圖6可知，在相同條件下，與GSPE siNrf2組細(xì)胞相比，GSPE組細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO1、GPX4、SLC7A11的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），結(jié)果表明抑制Nrf2后細(xì)胞的抗氧化能力降低，GSPE的保護(hù)作用減弱，從而增強(qiáng)了GP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞鐵死亡的敏感性。

圖6 抑制Nrf2信號(hào)通路后MIN6細(xì)胞內(nèi)GPX4、NQO1、HO-1、SLC7A11、Nrf2蛋白表達(dá)水平Fig.6 Protein expression levels of GPX4,NQO1,HO-1,SLC7A11 and Nrf2 in MIN6 cells after Nrf2 signaling pathway inhibition

3 討論

高血糖和脂質(zhì)代謝紊亂可能誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡[12]，研究表明，在長(zhǎng)期高水平的葡萄糖以及脂肪酸作用下，能夠?qū)е乱葝uβ細(xì)胞失代償，即胰島β細(xì)胞出現(xiàn)胰島素分泌不足，無(wú)法維持機(jī)體正常的血糖水平，胰島β細(xì)胞損傷是T2DM的關(guān)鍵標(biāo)志[13]。Shu Tingting等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞死亡是由于細(xì)胞內(nèi)鐵沉積導(dǎo)致ROS過(guò)度產(chǎn)生發(fā)生氧化應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的鐵沉積以及脂質(zhì)過(guò)氧化物的增加是誘發(fā)鐵死亡的主要原因[14]。Bruni等[15]研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin和RSL3處理能夠損傷胰島組織的功能和活力，但在使用DFO處理后能夠改善這種損傷。在本次研究中首先建立胰島β細(xì)胞損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，GP對(duì)MIN6細(xì)胞的損傷加重，細(xì)胞存活率不斷下降。加入DFO后改善細(xì)胞損傷，加入RSL3和Erastin加重了細(xì)胞損傷，但是加入Nec-1、Z-VAD-FMK、CQ并沒(méi)有對(duì)細(xì)胞存活率有改善作用，并且發(fā)現(xiàn)GP能夠?qū)е翿OS水平、MDA含量升高，這提示GP可能誘發(fā)MIN6細(xì)胞鐵死亡。

鐵死亡是鐵依賴(lài)的，以脂質(zhì)過(guò)氧化為特征的程序性死亡，其形態(tài)學(xué)變化主要是線粒體嵴消失，線粒體膜密度增加，且已被證實(shí)與多種疾病有關(guān)[16]。血清鐵蛋白升高是T2DM的危險(xiǎn)因素，能夠作為T(mén)2DM的早期診斷指標(biāo)之一[17-18]。Yasumura等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病模型中腎Ferritin蛋白表達(dá)水平升高；然而，Varghese等[20]研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)的雄性鼠中肝臟Ferritin蛋白表達(dá)水平降低。本研究發(fā)現(xiàn)GP會(huì)導(dǎo)致MIN6細(xì)胞Ferritin蛋白表達(dá)水平升高。TfR1和DMT1是鐵的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，TfR1是一種跨膜的糖蛋白，是鐵進(jìn)入細(xì)胞必需的蛋白，并能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵的濃度，TfR1的上調(diào)是細(xì)胞鐵死亡的顯著特征[21]。研究表明，DMT1上調(diào)會(huì)導(dǎo)致T2DM小鼠胰腺組織β細(xì)胞ROS水平升高和鐵的沉積[22]。研究發(fā)現(xiàn)，GP能夠誘導(dǎo)鐵代謝指標(biāo)TfR1、DMT1、Ferritin蛋白表達(dá)水平升高，因此，以上結(jié)果表明GP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞發(fā)生鐵沉積。

GSH是細(xì)胞中主要的非酶抗氧化劑，GSH是由谷氨酸、半胱氨酸以及甘氨酸縮合而成，具有直接的抗氧化作用，也是GPX4的合成底物[23]，MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物。胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)（cystine/glutamate transporter system，XCT）的表達(dá)也可用于鑒定鐵死亡的生物標(biāo)志物[24]。XCT是由溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）和溶質(zhì)載體家族3成員2（solute carrier family 3 member 2，SLC3A2）組成的異二聚體，其功能是將胱氨酸導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行GSH的合成和發(fā)揮抗氧化作用[25]。Wang Guoyan等[26]研究發(fā)現(xiàn)T-2毒素通過(guò)增加ROS的水平以及下調(diào)SLC7A11蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。ACSL4被證明是監(jiān)測(cè)鐵死亡的一個(gè)有用的生物標(biāo)志物，通過(guò)產(chǎn)生5-羥基二十基四烯酸介導(dǎo)的脂肪毒性來(lái)促進(jìn)鐵死亡發(fā)展[27]。下調(diào)抗氧化酶GSH、GPX4、SLC7A11表達(dá)，上調(diào)ACSL4蛋白表達(dá)水平表達(dá)，這表明GP會(huì)導(dǎo)致MIN6細(xì)胞鐵沉積，降低細(xì)胞的抗氧化能力。

GSPE屬于多酚化合物，含有低聚物和單體黃酮聚合物，除了具有強(qiáng)的抗氧化能力，還具有抗病毒、抗菌、抗炎的作用，既往的研究表明GSPE能夠通過(guò)發(fā)揮其強(qiáng)的抗氧化能力減輕GP飲食誘導(dǎo)的大鼠肝臟脂肪沉積，改善大鼠的血糖和脂代謝紊亂[28]。天然產(chǎn)物角鯊烯通過(guò)下調(diào)細(xì)胞中TfR1、ACSL4蛋白表達(dá)，上調(diào)SLC7A11和GPX4蛋白表達(dá)，增加細(xì)胞GSH含量，降低ROS熒光強(qiáng)度和MDA水平，拮抗Erastin誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡[29]。Li Dan等[30]研究發(fā)現(xiàn)，天然多酚類(lèi)化合物槲皮素通過(guò)抑制胰腺鐵沉積和胰島β細(xì)胞鐵死亡改善T2DM的病理發(fā)展過(guò)程。在本研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度10～30 mg/L GSPE對(duì)MIN6細(xì)胞活性沒(méi)有影響，GSPE可以提高GP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞的活性，能夠逆轉(zhuǎn)GP干預(yù)下MIN6細(xì)胞的鐵死亡特征，其中包括降低MDA含量、ROS水平，下調(diào)TfR1、DMT1和Ferritin、ACSL4蛋白表達(dá)水平表達(dá)，上調(diào)GSH、GPX4、SLC7A11蛋白表達(dá)水平表達(dá)。以上結(jié)果證實(shí)，GSPE能夠抑制GP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞鐵死亡。

Nrf2是細(xì)胞關(guān)鍵的維持氧化穩(wěn)定的調(diào)節(jié)因子，有證據(jù)表明Nrf2和鐵死亡有關(guān)，且鐵超載相關(guān)基因和脂質(zhì)過(guò)氧化基因是Nrf2的靶基因[31]。在氧化應(yīng)激或其他刺激下，能夠促進(jìn)Nrf2積累和核易位當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞核后，Nrf2與一種小的Maf蛋白結(jié)合啟動(dòng)抗氧化酶基因調(diào)控區(qū)的抗氧化/親電反應(yīng)元件（antioxidant/electrophile response elements，ARE）激活下游的II相解毒酶基因[32]。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2可通過(guò)調(diào)節(jié)SLC7A11、HO-1蛋白表達(dá)抑制酒精性肝病鐵死亡[33]。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Nrf2基因特異性敲除地小鼠中肝臟和脾臟含鐵含量增加以及ROS水平升高，進(jìn)而加劇小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)[34]，Liu Zixuan等[35]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2基因特異性敲除會(huì)降低SLC7A11表達(dá)，抑制GPX活性進(jìn)而加強(qiáng)Erastin誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞鐵死亡的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)，MIN6細(xì)胞在受到GP刺激下，Nrf2表達(dá)水平升高，GSPE能夠通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮其抗氧化能力，從而抑制GP誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡，此外，在抑制Nrf2后，GSPE抗氧化能力降低，下游的抗氧化酶HO-1、NQO1、GPX4、SLC7A11蛋白表達(dá)水平表達(dá)降低，細(xì)胞鐵死亡加速。

本研究結(jié)果表明，GSPE可能是通過(guò)激活MIN6細(xì)胞內(nèi)的Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)抗氧化酶表達(dá)，進(jìn)而減輕GP誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡，提高細(xì)胞存活率。