鄧代霞，李鳳蘭，李潮云，付 平，吳天祥,2,*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州食品工程職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽 551400）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以腸黏膜損傷、潰瘍、炎癥為主要特征的炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）[1]，主要發(fā)病于直腸和結(jié)腸，在臨床上，常見的IBD還包括克羅恩病[2-3]。由于UC具有易發(fā)作、難治愈、病因病機(jī)尚不明確等特性，世界衛(wèi)生組織將其列為難治病癥之一[4]。目前普遍認(rèn)為UC的發(fā)病機(jī)制與遺傳、環(huán)境、免疫異常、腸道菌群紊亂等相關(guān)，由諸多因素相互作用引起[5-7]。其臨床癥狀表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕、腹痛、腹瀉、糞便帶血或嚴(yán)重血便，嚴(yán)重者可誘發(fā)結(jié)直腸癌[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國UC的發(fā)病率逐年上升[9-10]。目前，常用的治療IBD的藥物種類主要以氨基水楊酸、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等為主[3,11]。但長期服用副作用大、可引起諸多不良反應(yīng)。一些傳統(tǒng)中草藥具有較好的抗炎效果，且中草藥具有高效、副作用小等特點(diǎn)，因此，從天然資源中開發(fā)新型藥物得到廣大研究者的關(guān)注[12]。

魚腥草（Houttuynia cordata）又名折耳根、蕺菜，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其味辛、性微寒，主要產(chǎn)于貴州、四川、云南等西南地區(qū)，作為貴州常見的藥食同源食物之一[13-14]，魚腥草主要含有多糖、脂肪酸、揮發(fā)油、多酚、生物堿、黃酮、萜類等生物活性物質(zhì)[15]，具有清熱解毒、利尿通淋[16]、抗炎抗菌[17]、抗病毒[18]、抗腫瘤[19]等作用。

目前，魚腥草抗炎藥理療效已取得一定的研究成果，相關(guān)研究表明，魚腥草素可增加動脈粥樣硬化模型大鼠體內(nèi)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10水平，降低腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6及IL-1β水平，從而發(fā)揮抗炎療效[20]。魚腥草的水提物可以降低乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠肝損傷體內(nèi)IL-6、TNF-α等炎癥因子的水平[21]，吳蘋等[22]研究發(fā)現(xiàn)魚腥草多糖能降低結(jié)腸炎小鼠血清中促炎因子、血清肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等的含量，調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂及減輕腸道損傷，董晶等[23]證實(shí)魚腥草多酚可通過降低結(jié)腸炎小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子水平緩解腸道炎癥反應(yīng)，根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，魚腥草在治療結(jié)腸炎方面的研究還比較少，故本實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）溶液構(gòu)建UC小鼠模型，評價(jià)魚腥草鮮汁對小鼠UC的緩解效果，以豐富魚腥草治療結(jié)腸炎的基礎(chǔ)研究，更好地驗(yàn)證魚腥草對小鼠結(jié)腸炎的改善作用，為魚腥草功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

C57BL/6J雄性小鼠，8 周齡，體質(zhì)量（22±2）g，SPF級，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。所有小鼠飼養(yǎng)于貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)條件：12 h/12 h明暗交替，溫度20～24 ℃，相對濕度60%～80%，動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)（編號：EAE-GZU-2021-P008）。

小鼠基礎(chǔ)飼料、墊料購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司；魚腥草產(chǎn)于貴陽市花溪區(qū)，洗凈后不添加水直接榨成魚腥草汁。

DSS 美國MP Biomedical公司；美沙拉嗪腸溶片葵花藥業(yè)集團(tuán)佳木斯鹿靈制藥有限公司；糞便隱血試劑盒 江蘇艾迪生生物科技有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液 武漢賽維爾生物有限公司；TNF-α、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、蛋白質(zhì)定量試劑盒（bicinchonininc acid，BCA）、D-乳酸（D-lactic acid，D-La）、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）試劑盒泉州市睿信生物科技有限公司；其他用于本實(shí)驗(yàn)的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CP114型電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；GL-200G-II型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SPECTRA MAX 190型酶標(biāo)儀 昆明納瑞科技有限公司；RM2016型病理切片機(jī) 德國徠卡儀器有限公司；Pannoramic DESKP-MIDIP250型掃描儀 匈牙利3Dhistech公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理

所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為6 組：空白組、模型組、陽性組及魚腥草汁低、中、高劑量組，每組12 只。除空白組外，其余各組采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3% DSS溶液建立UC小鼠模型，小鼠連續(xù)自由飲用7 d。于建模后第4天，按照0.1 mL/10 gmb的劑量開始灌胃不同試劑，其中空白組和模型組灌胃生理鹽水，陽性組灌胃美沙拉嗪（劑量200 mg/kgmb），低劑量組灌胃魚腥草汁（稀釋4 倍），中劑量組灌胃魚腥草汁（稀釋2 倍），高劑量組灌胃魚腥草原汁，連續(xù)灌胃10 d。

1.3.2 疾病活動指數(shù)評分

實(shí)驗(yàn)期間，每天早上9∶00稱量小鼠體質(zhì)量，并觀察小鼠糞便性狀及隱血情況，采用糞便隱血試劑盒測定糞便隱血分?jǐn)?shù)，根據(jù)文獻(xiàn)[24]中的方法，計(jì)算疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。DAI評分計(jì)算方法如公式（1）所示。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for DAI evaluation

1.3.3 結(jié)腸長度的測定

解剖小鼠后，快速分離結(jié)腸，用鑷子輕輕水平拉直，用直尺測量長度并記錄。

1.3.4 免疫器官指數(shù)測定

解剖小鼠后，快速分離胸腺、脾臟，稱量并記錄其濕質(zhì)量，按照公式（2）計(jì)算免疫器官指數(shù)。

1.3.5 血清LPS水平及D-La濃度測定

取小鼠血液靜置30 min后，3000 r/min離心15 min，取血清于離心管中備用，按照試劑盒說明書測定血清LPS水平及D-La濃度。

1.3.6 結(jié)腸組織炎癥因子的測定

用預(yù)冷的pH為7.2的0.1 mol/L磷酸緩沖鹽溶液沖洗小鼠結(jié)腸組織并剪碎，在冰上研磨制成勻漿液，根據(jù)BCA試劑盒測定結(jié)腸組織蛋白質(zhì)濃度后，再按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測步驟測定小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10質(zhì)量濃度。

1.3.7 結(jié)腸組織氧化應(yīng)激水平的測定

根據(jù)試劑盒操作說明書測定小鼠結(jié)腸組織中SOD、MPO活力和MDA含量。

1.3.8 組織病理學(xué)檢查

解剖小鼠后，取距肛門處1～2 cm的結(jié)腸組織，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的中性甲醛溶液固定24 h后，經(jīng)修剪、脫水浸蠟、包埋、切片（厚度4 μm）、蘇木精-伊紅染色法染色、封片后，在掃描儀下觀察各組的腸黏膜病理變化，并用相機(jī)采集圖像，參考文獻(xiàn)[24-25]中的方法進(jìn)行組織病理學(xué)評分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 結(jié)腸組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for histopathological evaluation of colon tissues

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Origin 2021軟件作圖，利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腥草汁對UC小鼠體質(zhì)量及DAI評分的影響

空白組小鼠在飼養(yǎng)期間反應(yīng)靈敏、精神狀況良好，糞便性狀無異常；與空白組相比，模型組小鼠從飼養(yǎng)第5天開始出現(xiàn)精神萎靡、稀便、血便等癥狀；與模型組相比，魚腥草汁低、中、高劑量組的小鼠精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)且稀便和血便情況明顯改善。

如圖1所示，與空白組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量從第3天開始降低，持續(xù)降低至喂養(yǎng)結(jié)束，魚腥草汁低、中、高劑量組與模型組比較，雖從第3天開始仍呈現(xiàn)降低趨勢，但體質(zhì)量均有所提高，DAI評分也有所降低；第14天，與模型組小鼠相比，魚腥草汁低、中、高劑量組及陽性組小鼠體質(zhì)量分別增加了26.70%、30.14%、35.54%、39.82%（P＜0.01），DAI評分分別降低了26.54%、32.97%、53.99%、58.68%（P＜0.01），呈劑量依賴性，其中高劑量組效果最好，效果接近陽性組。

圖1 小鼠體質(zhì)量（A）和DAI評分（B）Fig.1 Body mass (A) and DAI score (B) of mice

DAI評分升高、體質(zhì)量減輕、隱血、便血等是結(jié)腸炎重要特征[8]，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)魚腥草多糖可以降低結(jié)腸炎小鼠DAI評分，緩解腹瀉及便血程度[22]，本研究結(jié)果與此一致，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)?zāi)┢隰~腥草汁干預(yù)組均能減輕小鼠便血程度，中、高劑量干預(yù)組小鼠體質(zhì)量極顯著增加（P＜0.01），DAI評分極顯著降低（P＜0.01），結(jié)果表明，魚腥草可以改善UC小鼠生存狀態(tài)及臨床癥狀，具有較好的緩解作用。

2.2 魚腥草汁對UC小鼠結(jié)腸外觀及長度的影響

如圖2所示，模型組小鼠結(jié)腸長度明顯縮短、嚴(yán)重充血、黏連。各干預(yù)組小鼠結(jié)腸仍有部分充血、潰瘍，但較模型組有所減輕，模型組小鼠結(jié)腸平均長度為4.60 cm，空白組平均長度為7.17 cm，模型組小鼠結(jié)腸平均長度較空白組縮減了2.57 cm，縮短了35.84%（P＜0.01）。與模型組小鼠相比，魚腥草汁低、中、高劑量組結(jié)腸長度極顯著增加（P＜0.01），因此，魚腥草汁可以抑制UC小鼠結(jié)腸縮短。

圖2 各組小鼠結(jié)腸長度Fig.2 Colon length of mice in each group

2.3 魚腥草汁對UC小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是機(jī)體中重要的免疫器官，在小鼠炎癥和免疫反應(yīng)具有至關(guān)重要的作用[26]。如圖3所示，與空白組相比，模型組小鼠胸腺指數(shù)極顯著降低（P＜0.01）、脾指數(shù)極顯著升高（P＜0.01），經(jīng)過魚腥草汁干預(yù)后，低、中、高劑量組胸腺和脾臟指數(shù)逐漸向空白組趨近，其中，高劑量組胸腺指數(shù)較模型組升高了59.25%（P＜0.01），脾指數(shù)較模型組降低了51.09%（P＜0.01），綜上，魚腥草汁對結(jié)腸炎小鼠免疫器官指數(shù)具有調(diào)節(jié)作用。

圖3 魚腥草汁對免疫器官指數(shù)的影響Fig.3 Effect of Houttuynia cordata juice on immune organ indexes

2.4 魚腥草汁對UC小鼠腸道黏膜滲透性的影響

血清D-La濃度和LPS水平可間接反應(yīng)腸炎小鼠腸道黏膜滲透性[27]。如圖4所示，與空白組小鼠相比，模型組小鼠血清中D-La濃度和LPS水平極顯著升高（P＜0.01），表明腸黏膜屏障功能被破壞；與模型組相比，不同劑量的魚腥草汁均可降低由DSS引起的小鼠血清D-La濃度、LPS水平升高，其中高劑量組血清D-La濃度、LPS水平較模型組分別降低25.92%、45.24%（P＜0.01）。魚腥草有多種功能性成分，其揮發(fā)油、萜類化合物、多糖等物質(zhì)都具有較好的抗炎抗菌效果[15,17]，本研究結(jié)果顯示，魚腥草汁能夠降低DSS誘導(dǎo)的UC小鼠腸黏膜的通透性，可能是魚腥草中各種成分相互協(xié)同作用，抵御有害病菌及毒物入侵結(jié)腸組織，從而減輕UC小鼠腸道黏膜損傷。

圖4 魚腥草汁對血清D-La濃度（A）和LPS水平（B）的影響Fig.4 Effect of Houttuynia cordata juice on serum D-La (A) and LPS levels (B)

2.5 魚腥草汁對UC小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子的影響

TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10等炎癥因子分泌異常是導(dǎo)致腸道黏膜的炎性損傷的主要原因之一[28]。如圖5所示，與空白組相比較，模型組小鼠的結(jié)腸組織中促炎因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6分泌水平極顯著增加（P＜0.01），抗炎因子IL-4和IL-10分泌水平極顯著降低（P＜0.01），模型組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6含量較空白組分別增加了129.53%、126.25%、69.06%、85.49%；而IL-4和IL-10水平較空白組降低了58.27%、41.23%。與模型組小鼠相比，魚腥草汁中、高劑量組促炎因子分泌水平極顯著降低（P＜0.01），抗炎因子分泌水平極顯著升高（P＜0.01），其中，高劑量組TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6水平分別降低了33.21%、44.73%、32.88%、33.03%（P＜0.01）；IL-4、IL-10水平分別升高了76.10%、36.00%（P＜0.01）；前人研究表明DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型中TNF-α、IFN-γ、IL-1β等炎癥因子在血清、結(jié)腸組織中表達(dá)水平升高[25,29]，Lee等[30]研究發(fā)現(xiàn)，魚腥草提取物可以通過抑制促炎因子的表達(dá)減輕肥大細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；秦萍等[31]研究表明，魚腥草揮發(fā)油治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠后，能抑制血清中TNF-α、IL-1β及IL-6的表達(dá)；董晶等[23]研究發(fā)現(xiàn)魚腥草多酚抑制了TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子的分泌，本研究與前人研究結(jié)果一致。結(jié)果表明魚腥草能夠抑制促炎因子的釋放，促進(jìn)抗炎因子的釋放，減輕結(jié)腸炎的炎性反應(yīng)，保護(hù)結(jié)腸組織。

圖5 魚腥草汁對炎癥因子分泌水平的影響Fig.5 Effect of Houttuynia cordata juice on inflammatory cytokine levels

2.6 魚腥草汁對UC小鼠氧化應(yīng)激水平的影響

氧化應(yīng)激和氧化細(xì)胞損傷是結(jié)腸炎的重要標(biāo)志之一[32]，為評價(jià)魚腥草汁對小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激水平的影響，本實(shí)驗(yàn)測定了小鼠結(jié)腸組織中MDA含量和MPO、SOD活力。如圖6所示，與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中的MDA含量、MPO活力極顯著升高（P＜0.01），SOD活力極顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，魚腥草汁中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織中MDA含量較模型組分別降低45.27%、56.16%（P＜0.01），MPO活力分別降低了16.84%、34.05%（P＜0.01），SOD活力分別增加了48.82%、76.37%（P＜0.01）。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，魚腥草多糖、黃酮具有較強(qiáng)的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥自由基能力[33-34]，馬新方等[35]證明魚腥草多糖可降低衰老小鼠體內(nèi)MDA含量，提高SOD活力，具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗氧化活性。本研究表明，魚腥草中能調(diào)節(jié)UC小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，與前人研究結(jié)果[35]一致，應(yīng)該是魚腥草中多種功能性成分共同發(fā)揮作用減輕UC小鼠結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)。

圖6 魚腥草汁對小鼠氧化應(yīng)激水平的影響Fig.6 Effect of Houttuynia cordata juice on oxidative stress levels of mice

2.7 魚腥草汁對UC小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)及病理學(xué)評分的影響

如圖7、8所示，空白組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，隱窩結(jié)構(gòu)完整、腺體排列有序、杯狀細(xì)胞清晰可見、無炎性細(xì)胞浸潤；模型組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞、嚴(yán)重充血、糜爛、隱窩及杯狀細(xì)胞減少，大量炎性細(xì)胞浸潤。前人研究表明，DSS對小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)破壞性較大，引起結(jié)腸充血、病菌浸染健康組織，導(dǎo)致大量上皮細(xì)胞凋亡[29,32]，本研究模型組結(jié)腸病理分析與此結(jié)果一致。與空白組相比，模型組病理學(xué)評分極顯著升高（P＜0.01）。經(jīng)過魚腥草汁治療，低劑量組對結(jié)腸組織隱窩結(jié)構(gòu)有所修復(fù)，炎性細(xì)胞較模型組有所減少；中劑量組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)較完整，但仍可見部分黏膜結(jié)構(gòu)被破壞、隱窩結(jié)構(gòu)部分丟失，仍有炎癥細(xì)胞浸潤；高劑量組小鼠結(jié)腸組織損傷較輕、炎性細(xì)胞明顯減少、杯狀細(xì)胞數(shù)量增多、隱窩結(jié)構(gòu)較完整，病理學(xué)評分較模型組極顯著降低（P＜0.01），表明魚腥草能保護(hù)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜不被破壞，對其結(jié)腸損傷有緩解作用。

圖7 各組小鼠結(jié)腸組織病理切片F(xiàn)ig.7 Pathological sections of colon tissues of mice in each group

圖8 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分Fig.8 Pathological score of colon tissue in each group

3 結(jié)論

IBD是一種病因不明、難治愈、易復(fù)發(fā)的慢性腸道炎癥性疾病，以體質(zhì)量減輕、便血、腸道炎癥及腸黏膜損傷為主要特征[36-37]。研究表明魚腥草具有較好的抗炎作用[38]，本研究發(fā)現(xiàn)，魚腥草可以降低DSS誘導(dǎo)的UC小鼠便血頻率、DAI評分，抑制結(jié)腸縮短，降低促炎因子分泌水平，增加抗炎因子分泌水平，降低血清中D-La濃度和LPS水平，魚腥草汁高劑量組較模型組分別降低了25.92%、45.24%（P＜0.01），還可以通過調(diào)節(jié)UC小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平及緩解腸道損傷；與模型組相比，魚腥草汁中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織中MDA含量較模型組分別降低45.27%、56.16%（P＜0.01），MPO活力分別降低了16.84%、34.05%（P＜0.01），SOD活力分別增加了48.82%、76.37%（P＜0.01）。綜上，魚腥草可通過調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，降低腸炎小鼠腸道通透性及緩解腸道損傷，對小鼠UC起到緩解及保護(hù)作用，本研究可為魚腥草預(yù)防UC等相關(guān)保健品的開發(fā)提供理論參考。但魚腥草治療UC小鼠的適宜劑量以及發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。