楊汝晴，陳玉磊,2，孫樂常,2，張凌晶,2，劉光明,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.大連工業(yè)大學海洋食品深加工協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

魚類是優(yōu)質蛋白的重要來源，營養(yǎng)價值較高。魚骨骼肌由肌隔膜分開的肌節(jié)重疊而形成[1]，這一獨特的結構特征使魚肉相較于哺乳動物和禽類動物的肌肉更加柔軟，也更易被內源性蛋白酶分解[2]。哺乳動物宰殺后的肌肉軟化可以提高肉的嫩度，并改善肉的品質[3]。然而，魚類等水產(chǎn)品在宰后低溫貯藏期間軟化的時間短，易發(fā)生微生物腐敗而導致品質降低[4-7]。

魚的肌肉硬度因貯藏過程中結締組織結構的改變而降低。在魚肌肉的結締組織中，膠原蛋白是重要的組成部分，膠原蛋白對維持魚肉的完整性和肌肉的黏結性起著至關重要的作用[8]，膠原蛋白的降解也是導致肌肉軟化的一個重要因素[9]。通常，膠原蛋白被認為是一種相對穩(wěn)定的蛋白質，在冷藏過程中，膠原原纖維由于內源性膠原酶的作用導致其與肌纖維之間出現(xiàn)縫隙，其他非特異性蛋白酶進一步降解引起肌肉品質的劣化[4]?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）屬于鋅依賴內肽酶超家族，在組織重塑、轉換和生長過程中參與胞外基質成分的新陳代謝。MMPs主要由成纖維細胞作為前酶合成和分泌，膠原酶（MMP-1、MMP-8和MMP-13）被激活后對膠原蛋白進行初始切割，隨后明膠酶（MMP-2和MMP-9）進一步參與降解[10]。在魚類中，MMPs通過水解膠原蛋白從而導致魚類肌肉質構品質的下降[11]。

鱸魚（Lateolabrax japonicus）學名日本真鱸，其肉質細膩鮮美、少有魚骨，因豐富的營養(yǎng)價值和獨特的風味受到消費者的廣泛歡迎。2020年，我國海水養(yǎng)殖鱸魚產(chǎn)量達19.2萬 t，在養(yǎng)殖海水魚中位居第二[12]。目前，國內外對鱸魚的研究主要集中在利用保鮮技術延長貨架期方面[5,13]，而對于鱸魚肌肉蛋白在貯藏過程中的生化變化關注較少。通過研究鱸魚在冷藏過程中的品質變化，有利于揭示其規(guī)律，為建立科學的鱸魚保鮮方法提供理論依據(jù)。因此，本研究以鱸魚為研究對象，探討其在4 ℃冷藏條件下理化性質、質構、MMPs活力等指標的變化，利用免疫組織化學技術分析冷藏過程中I型膠原蛋白的變化，旨在為了解鱸魚在冷藏條件下的品質變化機理提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鱸魚購于廈門市集美菜市場，體質量（1.26f 0.34）kg、體長（32.92f 5.23）cm。

平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Masson染色套裝、兔抗I型膠原蛋白多克隆抗體、免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液 武漢賽維爾生物科技有限公司；MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A2pr(Dnp)-Ala-Arg-NH2熒光底物 日本Peptide Institute公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 青島福林生物化學公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

PT-2100組織搗碎機 瑞士Kinematica公司；Avanti J-26SXP高速冷凍離心機 美國Beckman公司；ATN-300全自動凱氏定氮儀 鶴壁市大德實驗設備有限公司；DS-CHN100 E100正置光學顯微鏡、DS-U3成像系統(tǒng)日本尼康公司；Starter 3100 pH計 美國Ohaus公司；TA.XT Plus/50質構儀 英國SMS公司；FP-8200熒光分光光度計 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 鱸魚預處理

將鱸魚碎冰冷卻后處死，去內臟并用滅菌去離子水沖洗干凈，瀝干水分后裝入密封袋中，于4 ℃冷庫貯藏12 d，每2 d相同時間點取樣進行各項指標測定。

1.3.2 pH值的測定

參照GB 5009.237-2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》，取5 g魚肉，加入25 mL煮沸后冷卻的蒸餾水，組織搗碎，靜置30 min后，4 ℃、15000hg離心5 min，用pH計測定上清液的pH值。

1.3.3 菌落總數(shù)的測定

參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)的測定》，取1 g魚肉，加入9 g生理鹽水，搗碎，再按體積比1∶10進行稀釋，在培養(yǎng)皿中加入1 mL稀釋液，然后倒入平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，然后于（30f 1）℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，計算菌落總數(shù)，結果以lg（CFU/g）表示。

1.3.4 總揮發(fā)性鹽基氮含量的測定

參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》，取5 g不同冷藏時間的鱸魚魚肉，加入100 mL煮沸后冷卻的蒸餾水，組織搗碎，靜置30 min后，4 ℃、15000hg離心30 min，濾紙過濾。吸取濾液10.0 mL于消化管中，加入10 mL 1 g/100 mL MgCl2溶液，20 mL硼酸為吸收液，蒸餾5 min，用0.01 mol/L鹽酸標準滴定溶液進行滴定。用10 mL蒸餾水作空白對照。總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量按式（1）計算。

式中：X表示TVB-N含量/（mg/100 g）；V1、V2分別表示試樣和空白消耗的鹽酸標準滴定溶液體積/mL；c表示鹽酸標準滴定溶液濃度/（mol/L）；m表示試樣質量/g；14表示滴定1 mL標準試樣相當于氮的摩爾質量/（g/mol）；100為單位換算系數(shù)。

1.3.5K值的測定

根據(jù)SC/T 3048-2014《魚類鮮度指標K值的測定 高效液相色譜法》和閔娟等[14]的方法，并略作修改。取1 g魚肉，加入5 mL體積分數(shù)10%高氯酸溶液，4 ℃、15000hg下離心15 min，取上清液。沉淀物中加入4.5 mL體積分數(shù)5%高氯酸溶液，混勻，再次離心15 min，重復2 次。用NaOH溶液調上清液pH值至6.0～6.4，整個過程在冰上進行。再次離心，沉淀加入8 mL 5%高氯酸-氫氧化鉀中性液，離心，合并上清液，用超純水定容至25 mL，過0.22 μm水系膜后用于K值測定。

高效液相色譜條件[14]：色譜柱SHODEX Asahipak GS-320 HQ（7.5 mmh 300 mm）；流動相為205 mmol/L NaH2PO4-205 mmol/L H3PO4（300∶7，V/V）；流速0.6 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長260 nm；進樣量20 μL。K值按式（2）計算。

式中：CATP、CADP、CAMP、CIMP、CHxR、CHx分別為三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、次黃嘌呤核苷、次黃嘌呤含量/（μmol/g）。

1.3.6 質構特性的測定

取貯藏不同時間鱸魚骨骼肌，剪切成長、寬、高均為1.5 cm的魚塊，采用質構儀測定硬度。測定條件：平底柱形探頭P/6、測試速率1 mm/s、壓縮程度60%、接觸力5.0 gf。平行測定3 次。

1.3.7 Masson染色

肌肉組織經(jīng)過固定液固定、石蠟包埋和蠟塊修整，將修整好的蠟塊置于石蠟切片機切片。將厚度3～4 μm的石蠟切片脫蠟至水，采用Masson復合染色液進行染色，隨后切片用1%冰醋酸漂洗分化，乙醇脫水，中性樹膠封片，用顯微鏡進行鏡檢并采集圖像分析。該項工作委托武漢賽維爾生物科技有限公司完成。

1.3.8 I型膠原免疫組化分析

將組織切片置于抗原修復緩沖液中進行抗原修復，切片放入體積分數(shù)3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片置于磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中，在脫色搖床上晃動洗滌，在組化圈內滴加3%牛血清白蛋白溶液均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。輕輕甩掉封閉液，加入兔抗鼠I型膠原一抗，4 ℃孵育過夜。然后加入二抗（辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白G）室溫孵育50 min。切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，膠原陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。再用蘇木素復染3 min，自來水沖洗，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來水沖洗，蘇木素返藍液返藍，自來水沖洗。脫水，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢并采集圖像分析。該項工作委托武漢賽維爾生物科技有限公司完成。

1.3.9 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

取不同貯藏時間鱸魚肌肉樣品，加入4 倍體積Tris-HCl緩沖液（20 mmol/L、pH 8.0），均質，加入2 倍體積的蛋白溶解液（含20 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素、1%十二烷基硫酸鈉、2%β-巰基乙醇，pH 8.0），95 ℃加熱20 min，于－20 ℃貯藏備用。待樣品全部制備完成，采用丙烯酰胺質量分數(shù)為8%的分離膠和5%的濃縮膠對樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）。利用Image J軟件進行光密度分析。蛋白降解比例按式（3）計算。

式中：ODn為貯藏第n天樣品蛋白電泳條帶光密度值；OD0為貯藏第0天樣品蛋白電泳條帶光密度值。

1.3.10 MMPs活力測定

取5 g魚肉，置于4 倍體積的Buffer A（含20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L CaCl2，pH 8.0）中充分搗碎，4 ℃、15000hg離心20 min制備粗酶液。根據(jù)Knight等[15]的方法，在850 μL Buffer A中加入100 μL粗酶液，再加入50 μL濃度為10 μmol/L的熒光底物（MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A2pr(Dnp)-Ala-Arg-NH2）。在35 ℃下反應30 min，加入1.5 mL終止液（甲醇-異丙醇-蒸餾水（35∶30∶35，V/V））。用熒光分光光度計在328 nm激發(fā)波長和393 nm發(fā)射波長下測定釋放的MOCAc-Pro-Leu-Gly熒光強度。MMPs活力單位定義為每分鐘釋放1 nmol MOCAc-Pro-Leu-Gly的量。以0 d魚肉中的MMPs活力為100%，計算相對活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有實驗均重復3 次。采用Origin 8.0軟件繪圖。圖片采用Adobe Illustrator CS5軟件進行標注。

2 結果與分析

2.1 鱸魚冷藏過程中肌肉理化性質變化

如圖1A所示，鱸魚肌肉的初始pH值為7.01，在貯藏初期，由于糖原和ATP的分解，pH值逐步降低至6.82。隨貯藏時間的延長，蛋白質分解產(chǎn)生堿性含氮物質，從而導致pH值升高[5]，貯藏至第12天，鱸魚肌肉pH值為7.43。TVB-N含量被廣泛用于評價魚類的新鮮度，大多數(shù)新鮮海洋魚類的可接受TVB-N含量限度為30 mg/100 g。本研究結果顯示，TVB-N含量在鱸魚4 ℃貯藏4 d后明顯增加，并在第8天超過限值（圖1B）。揮發(fā)性堿性化合物主要由腐敗微生物代謝蛋白質產(chǎn)生，因此菌落總數(shù)是評價魚肉質量的重要指標。鮮魚可接受的菌落總數(shù)臨界值為6.0（lg（CFU/g））[16]。通常，冷藏一段時間的魚肉仍可保持其新鮮度，但是低溫不能完全抑制微生物的生長。新鮮魚肉的初始菌落總數(shù)為3.33（lg（CFU/g）），隨著貯藏時間的延長，第6天和第8天時菌落總數(shù)分別達到5.47（lg（CFU/g））和6.35（lg（CFU/g））（圖1C），第8天超過臨界值。K值是反映魚肉新鮮度的重要生化指標，K值越低新鮮度越高。如圖1D所示，新鮮鱸魚的K值為6.76%，隨冷藏時間延長K值逐漸增加，在第8天達67.71%，超過60%的可接受值[17]。通過對鱸魚冷藏期間的TVB-N含量、菌落總數(shù)以及K值等指標進行綜合評價，得出4 ℃冷藏條件下，鱸魚的最佳貯藏期為8 d以內。

圖1 4℃冷藏期間鱸魚肌肉理化性質的變化Fig.1 Changes in physicochemical properties of Lateolabrax japonicus muscle during cold storage at 4℃

2.2 鱸魚冷藏過程中肌肉總蛋白SDS-PAGE分析結果

如圖2A所示，在貯藏6 d以內，鱸魚肌肉中的肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）和肌動蛋白沒有發(fā)生明顯變化。隨貯藏時間進一步延長，MHC逐漸降解為150 kDa左右，但肌動蛋白未發(fā)生明顯降解。光密度值分析結果顯示，在貯藏6 d以內，MHC降解比例為10%以下，而當貯藏時間至第8天時，約32%的MHC發(fā)生降解，至第12天時降解比例達50%。肌動蛋白在整個貯藏過程中降解均不明顯（圖2B）。因此，低溫貯藏前期鱸魚肌肉蛋白組成基本穩(wěn)定，貯藏后期MHC發(fā)生明顯降解。

圖2 4℃冷藏過程中鱸魚肌肉蛋白降解的SDS-PAGE圖（A）及光密度分析結果（B）Fig.2 SDS-PAGE (A) pattern and optical density analysis result (B) of proteins in the muscle of Lateolabrax japonicus during cold storage at 4℃

2.3 鱸魚冷藏過程中肌肉組織形態(tài)的變化

骨骼肌主要由肌原纖維和結締組織組成，結締組織對肌肉組織的完整性和機械支撐有重要作用。為了分析貯藏期間鱸魚肌肉微觀結構變化，對在4 ℃下分別放置0、2、6、12 d的鱸魚肌肉進行Masson染色，檢測肌肉組織形態(tài)學變化情況。由圖3可知，Masson染色法較好地區(qū)分了肌原纖維和膠原纖維，其中肌原纖維呈紅色，而膠原纖維呈藍色。貯藏初期（0～2 d），鱸魚背部肌肉纖維排列緊密，結構完整，纖維間隙均勻（圖3A、B）；貯藏至第6天，細胞間隙增大，肌內膜變細，肌纖維變得疏松（圖3C）；貯藏至第12天，包裹肌纖維的肌膜降解，肌纖維明顯斷裂，組織結構變得模糊（圖3D）。

圖3 Masson染色分析4℃冷藏過程中鱸魚肌肉形態(tài)的變化Fig.3 Morphological changes of Lateolabrax japonicus muscle during cold storage at 4℃ evaluated by Masson staining

2.4 I型膠原蛋白的免疫組化分析結果

肌膜主要由I型膠原構成，肌內膜是由I型膠原與少量III型膠原共同構成。為了更好地分析冷藏過程中I型膠原的分布以及變化情況，采用免疫組織化學染色標記肌肉組織中的I型膠原。免疫反應采用DAB顯色液使膠原陽性區(qū)域呈現(xiàn)棕黃色。由圖4可知，魚肉中I型膠原主要存在于肌纖維縫隙的肌內膜和包裹著肌纖維的肌膜。肌內膜提供強大抗拉功能并呈現(xiàn)一定規(guī)律的網(wǎng)狀結構，肌膜對肌纖維結構的完整性起支撐作用且呈現(xiàn)有序的平行排列。在新鮮狀態(tài)下（0 d），結締組織中的肌內膜顯色明顯，包裹肌纖維的肌膜略有顯色（圖4A）。貯藏至第2天，肌膜顯色逐漸清晰，可能是肌膜與肌纖維開始解離，膠原蛋白更多外露，與抗體反應的比表面積增加從而導致顏色加深。當冷藏至第6天，肌膜顯色進一步加深，表明肌膜與肌纖維間的緊密結合程度減弱（圖4C）。當貯藏至第12天，肌膜與肌纖維發(fā)生明顯分離，肌纖維的緊密結構被破壞（圖4D）。因此，冷藏期間魚肉結締組織中的I型膠原蛋白發(fā)生了明顯分解。

圖4 免疫組化分析4℃冷藏過程中I型膠原蛋白的變化Fig.4 Immuno-histochemical analysis of changes in type I collagen during cold storage at 4℃

2.5 鱸魚冷藏過程中肌肉硬度和MMPs活力的變化

如圖5所示，貯藏初期，鱸魚肌肉硬度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，貯藏2 d后，隨著貯藏時間的延長而逐漸降低。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶對膠原蛋白的降解與魚肉彈性的下降密切相關，因此魚肉中內源性蛋白酶被認為是導致魚肉變軟的重要原因。其中，MMPs主要參與胞外基質的降解與重塑，能夠分解魚體肌肉中不同類型的膠原蛋白[11]。采用熒光肽底物對貯藏期間鱸魚肌肉中MMPs活力進行分析，結果如圖5所示。在新鮮狀態(tài)下能檢測到MMPs活力，冷藏期間MMPs活力持續(xù)增強，12 d約為初始酶活力的2 倍。正常生理條件下，MMPs以酶原的形式分泌到胞外，并通過激活途徑產(chǎn)生有活性的酶，參與胞外基質的降解與重塑[10]。鱸魚在4 ℃貯藏過程中，無活性的MMPs酶原被激活產(chǎn)生更多活性酶，從而參與魚死后肌肉軟化過程。

圖5 鱸魚4℃冷藏期間肌肉硬度和MMPs活力的變化Fig.5 Changes in hardness and MMPs activity of Lateolabrax japonicus muscle during cold storage at 4℃

3 討論

魚死后會發(fā)生僵直、自溶、腐敗等一系列生化變化。在此過程中，蛋白質降解導致肌肉結構被破壞，從而使魚的品質降低[18-19]。低溫貯藏是控制魚類品質下降的常用方法。雖然低溫貯藏一定程度降低了蛋白酶的活力，抑制了微生物的生長，但由于反應的不可逆性，鮮度降低與品質劣化仍不可避免[20]。肌肉pH值是魚類鮮度變化的一項評價指標。新鮮鱸魚肌肉pH值接近中性，貯藏0～2 d，pH值逐步降低，pH值的輕微下降是由于ATP及其代謝物分解釋放氫離子的積累[2]。隨著魚體進入僵后階段，蛋白質、脂類和碳水化合物通過自溶和微生物分解而產(chǎn)生的氨基酸和含氮化合物，導致肌肉pH值增加[5]，而這些氨基酸和含氮化合物為腐敗菌繁殖提供了基質。大多數(shù)新鮮海洋魚類菌落總數(shù)和TVB-N含量的可接受性限值分別為6（lg（CFU/g））和30 mg/100 g，低溫貯藏至第8天，鱸魚的菌落總數(shù)和TVB-N含量超過限值。鱸魚的TVB-N含量隨著微生物的生長而進一步增加，表明TVB-N主要由腐敗微生物的代謝活動產(chǎn)生[2]。K值是評估魚類新鮮度的重要指標，ATP分解產(chǎn)生與K值相關的系列產(chǎn)物。魚肉的自溶作用和酶促反應導致ATP在冷藏過程中加速降解，因此K值的增加與魚肉新鮮度降低有關[21]。

在魚類骨骼肌中，肌原纖維蛋白雖然是其主要成分，但肌內膜和肌膜等結締組織對維持肌肉的完整性和肌肉的力學性能具有重要作用。Sato等[22]利用電子顯微鏡觀察冷藏后軟化的沙丁魚肌肉組織，發(fā)現(xiàn)魚肉結締組織變薄，而肌原纖維的結構仍較為完整。本研究結果表明，雖然4 ℃貯藏初期（2～4 d）鱸魚的pH值和肌肉硬度有所降低，但肌原纖維蛋白中的重要組成蛋白MHC和肌動蛋白無明顯變化。通過Masson染色發(fā)現(xiàn)，新鮮的鱸魚背部肌肉組織排列緊密良好、結構完整，隨著貯藏時間延長至第6天，肌內膜發(fā)生降解，細胞間隙增大，肌原纖維更易被內源性蛋白酶降解產(chǎn)生含氮化合物，使pH值逐漸升高，為腐敗菌繁殖提供有利條件，隨后菌落總數(shù)和TVB-N含量逐漸增加。魚肉的肌內膜和肌膜主要組成成分為I型膠原。貯藏至12 d時，鱸魚肌肉結締組織中肌膜顯著降解，肌纖維明顯斷裂，組織結構變得模糊。以上結果表明，結締組織蛋白的降解是魚類軟化的重要因素[23]。膠原蛋白作為結締組織的重要組成成分，對魚肉的硬度和結構維持起重要作用[24]。

魚肉質地對魚的新鮮度、品質評價有重要影響。貯藏2 d后，鱸魚肌肉的硬度隨著貯藏時間的延長而逐漸降低。Kubota等[25]對活體牙鲆注射蛋白酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)MMPs抑制劑能顯著抑制牙鲆死后冷藏期間的肌肉軟化。Suárez等[26]研究發(fā)現(xiàn)，真鯛肌肉冷藏期間膠原蛋白含量的減少伴隨著魚肉硬度的下降。膠原蛋白的三股螺旋構象穩(wěn)定性高，可耐受多種蛋白酶的降解[27]，而MMPs是能夠特異性降解膠原蛋白的內源性蛋白酶[10]。Martinez等[28]研究也發(fā)現(xiàn)大西洋鮭魚軟化肌肉中MMPs活力不斷升高。鱸魚在4 ℃貯藏過程中MMPs活力增加，可能是由于無活性的MMPs酶原被激活為成熟的MMPs。膠原蛋白被特異性膠原酶（MMP-1、MMP-8和MMP-13）初始切割后，結構被破壞，穩(wěn)定性變差，易被明膠酶（MMP-2和MMP-9）進一步降解[29-30]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚MMP-2能降解I型和V型膠原，從而參與肌肉軟化[31]。Kubota等[32]報道了牙鲆MMP-9通過降解I型膠原參與肌肉蛋白的降解。綜上所述，鱸魚在4 ℃冷藏過程中，由于內源性蛋白酶對I型膠原的降解，使其結構被破壞，肌膜與肌纖維產(chǎn)生間隙，導致肌纖維更易被蛋白酶分解，加快肌肉的自溶過程，影響食用品質，而I型膠原的降解是鱸魚肌肉軟化的主要因素之一。

4 結論

本實驗通過對4 ℃冷藏過程中鱸魚肌肉pH值、TVB-N含量、菌落總數(shù)、K值、質構、MMPs活力等指標測定，發(fā)現(xiàn)鱸魚品質在第8天超過臨界值。盡管貯藏8 d后鱸魚肌肉蛋白中肌原纖維蛋白MHC開始降解，但肌肉結締組織中I型膠原的降解是導致肌肉軟化的主要原因，而MMPs是降解I型膠原的主要酶類。